薤白對高脂血癥模型大鼠血脂水平的影響及機(jī)制研究

鞠楷 萬語嫣 張開蓮

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0976-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.27

摘 要 目的：考察薤白對高脂血癥模型大鼠血脂水平的影響及機(jī)制，為薤白降血脂的臨床應(yīng)用提供參考。方法：取10只正常大鼠作為正常對照組，飼以普通飼料；另取50只大鼠飼以高脂飼料，復(fù)制高脂血癥大鼠模型。取成模大鼠40只隨機(jī)分為模型組（飼以高脂飼料）和薤白低、中、高劑量組（0.83、1.67、2.50 g/kg，分別飼以含10%薤白的高脂飼料8.3、16.7、25.0 g/kg，不足采食量者用高脂飼料補足）。飼養(yǎng)45 d后，檢測大鼠血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）含量，計算大鼠肝、脾、腎、心臟指數(shù)，并檢測大鼠肝組織中低密度脂蛋白受體（LDLR）、肝X受體α（LXRα）mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL-C含量和肝指數(shù)顯著升高，血清中HDL-C含量和肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，薤白各劑量組大鼠血清中TC、LDL-C含量顯著降低，HDL-C含量顯著升高；且薤白中、高劑量組大鼠肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平顯著升高，肝、脾指數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：薤白具有較好的降血脂作用，其機(jī)制可能與上調(diào)肝組織中LDLR、LXRα mRNA的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 薤白；高脂血癥；降血脂；低密度脂蛋白受體；肝X受體α；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the effect and mechanism of Allii macrostemonis bulbus on blood lipid levels in hyperlipidemia model rats， and to provide reference for clinical use of Allii macrostemonis bulbus to reduce blood lipid. METHODS： A total of 10 normal rats were included in normal control group and given common diet. Other 50 rats were given hyperlipid diet to induce hyperlipidemia rat model. 40 model rats were randomly divided into model group （hyperlipid diet）， Allii macrostemonis bulbus low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.83， 1.67， 2.50 g/kg， fed by hyperlipid diet which containing 10%Allii macrostemonis bulbus 8.3， 16.7， 25.0 g/kg， fill with hyperlipid feed in patients with insufficient food intake）. After fed for 45 d， the contents of TC， TG， LDL-C and HDL-C in serum of rats were detected. Liver， spleen， renal and cardiac indexes of rats were calculated. mRNA expression of low density lipoprotein receptor （LDLR） and liver X-receptor α （LXRα）were detected in liver tissue of rats. RESULTS： Compared with normal control group， the contents of TC and LDL-C in serum and liver index of rats were increased significantly in model group， while the content of HDL-C in serum and mRNA expressions of LDLR and LXRα in liver tissue were decreased significantly， with statistical significance （P<0.01）. Compared with model group， the contents of TC and LDL-C in serum were decreased significantly in Allii macrostemonis bulbus groups， while the content of HDL-C was increased significantly. mRNA expressions of LDLR and LXRα in liver tissue were increased significantly in Allii macrostemonis bulbus medium-dose and high-dose groups， while liver and spleen indexes were decreased significantly， with statistical significance （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Allii macrostemonis bulbus shows good blood-lipid lowering effect， the mechanism of which may be associated with up-regulating mRNA expressions of LDLR and LXRα in liver tissue.

KEYWORDS Allii macrostemonis bulbus； Hyperlipidemia； Blood-lipid lowering； Low density lipoprotein receptor； Liver X-receptor α； Rat

我國成人高脂血癥的患病率為20%，因飲食及作息不健康等問題，該癥患病人群有年輕化趨勢[1]。此癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化、冠心病、腦卒中等心腦血管疾病的首要危險因素[2]，有效地控制高脂血癥是預(yù)防心腦血管疾病的關(guān)鍵。薤白為百合科植物小根蒜（Allium macrostemon Bge.）或薤（Allium chinense G.Don）的干燥鱗莖[3]，別名野白頭、小根蒜、薤白頭，主要成分有甾體皂苷、揮發(fā)油、多糖等?，F(xiàn)代科學(xué)研究顯示，薤白可降低血脂，并具有降壓、清除亞硝酸鹽、抗氧化等作用[4]。在脂代謝途徑中，低密度脂蛋白受體（LDL receptor，LDLR）、肝X受體α（Liver X-receptor α，LXRα）的功能分別為清除總膽固醇（TC）和調(diào)節(jié)TC平衡，這對維持血脂水平穩(wěn)定有重要作用。本研究擬通過考察薤白對高脂血癥模型大鼠血脂水平及脂代謝調(diào)控基因LDLR和LXRα表達(dá)的影響，從而探討其降血脂的作用及可能的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

AU680型全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；DS1000型高效組織細(xì)胞破碎儀（湖北新縱科病毒疾病工程技術(shù)有限公司）；Centrifuge 5427R型臺式高速冷凍離心機(jī)（德國艾本德公司）；DYY-11B型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；CFX ConnectTM型實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀和ChemiDocTM XRS+型凝膠成像儀（美國伯樂公司）。

1.2 飲片與試劑

薤白（瀘州天植中藥飲片有限公司，批號：17040101），飲片經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)生藥教研室莊元春副教授鑒定為真品；TC（批號：D1703083）、三酰甘油（TG，批號：D1705093）、低密度脂蛋白（LDL-C，批號：D1703079）、高密度脂蛋白（HDL-C，批號：D1705082）檢測試劑盒（上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司）；非凍型組織RNA保存液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20170920）；總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號：Q5615]；反轉(zhuǎn)錄（批號：AK4601）、RT-PCR（批號：AKA806）試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]；LDLR、LXRα引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易公司合成。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，♂，7周齡，體質(zhì)量190～210 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011。大鼠購入后分籠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心屏障系統(tǒng)中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24 ℃、濕度為40%～70%、光照時間為8：00～20：00，飼養(yǎng)期間自由飲水和采食。

1.4 飼料

高脂飼料由15%豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉和63.6%基礎(chǔ)飼料組成。含薤白粉末的高脂飼料由10%薤白粉末、15%豬油、20%蔗糖、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉和53.6%基礎(chǔ)飼料組成。飼料均由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取10只作為正常對照組，飼以普通飼料；其余50只大鼠飼以高脂飼料。30 d后，檢測大鼠血脂水平，血脂升高并與飼喂普通飼料大鼠差異有統(tǒng)計學(xué)意義者為造模成功[5-7]。選取40只造模成功的大鼠，稱體質(zhì)量后隨機(jī)分為模型組和薤白低、中、高劑量（0.83、1.67、2.50 g /kg，折算成含薤白粉末的高脂飼料分別為8.3、16.7、25.0 g/kg，分別為人臨床用量的10、20、30倍），每組10只。薤白低、中、高劑量組大鼠飼以相應(yīng)量含10%薤白粉末的高脂飼料，不足自由采食量的以未含薤白粉末的高脂飼料補足；正常對照組大鼠繼續(xù)飼以普通飼料；模型組大鼠繼續(xù)飼以高脂飼料。各組大鼠實驗期間均自由飲水和采食。

2.2 血液和組織樣本的采集

大鼠飼養(yǎng)45 d后，禁食不禁水12 h，稱體質(zhì)量，然后以1%的戊巴比妥鈉按0.3～0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉，心臟采血（其中正常對照組大鼠取血過程中死亡2只），收集血液標(biāo)本，靜置30 min，以1 006×g離心5 min，分離血清，將血清保存于-20 ℃冰箱中，待測。然后解剖大鼠，快速取出肝、脾、腎、心等臟器組織，稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù)[臟器指數(shù)（%）=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%]；并取一部分肝組織，迅速置于非凍型組織RNA保存液中，保存于-20 ℃冰箱中，待測。

2.3 血清中血脂指標(biāo)水平的測定

采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平的測定

取保存于非凍型組織RNA保存液中的肝組織約30 mg，加裂解液1 mL，采用高效組織細(xì)胞破碎儀以75 Hz振蕩頻率破碎15 s，按試劑盒說明提取各組大鼠肝組織中總RNA。運用1.3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀觀察總RNA是否降解，隨后將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制PCR反應(yīng)體系20 μL：混合cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ緩沖液10 μL，無酶水6.4 μL。RT-PCR的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60.7 ℃退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，擴(kuò)增45個循環(huán)。以β-激動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，采用2-ΔΔct法測定肝組織中LDLR、LXRα的mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列及擴(kuò)增長度見表1。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，當(dāng)方差齊時組間兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時組間兩兩比較采用Dunnetts T3檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠血脂指標(biāo)水平測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組大鼠血清中TC、LDL-C含量顯著增加（P<0.01），HDL-C含量顯著降低（P<0.01），TG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，薤白各劑量組大鼠血清中TC、LDL-C含量顯著降低（P<0.05或P<0.01），HDL-C含量顯著增加（P<0.05或P<0.01），TG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），各組大鼠血脂指標(biāo)測定結(jié)果見表2。

3.2 大鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組大鼠肝指數(shù)顯著升高（P<0.01），脾、腎、心臟指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，薤白中、高劑量組大鼠肝、脾指數(shù)顯著降低（P<0.05或P<0.01），薤白低劑量組大鼠各臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），各組大鼠臟器指數(shù)測定結(jié)果見表3。

3.3 肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，薤白中、高劑量組大鼠肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.01），且呈劑量依賴性；薤白低劑量組大鼠肝組織中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），各組大鼠肝組中LDLR、LXRα mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表4。

4 討論

本研究采用將藥物混合于飼料中的給藥方式，主要是因考察的藥物薤白含揮發(fā)油成分多，且其中揮發(fā)油是降血脂的重要有效成分。預(yù)實驗結(jié)果表明，薤白水煎煮會失去這部分有效成分，降低降血脂效果，故本研究采用全藥材打粉混合于飼料中的給藥方式，以保證能完全利用該藥物的降脂有效成分。此外，按照大鼠1 d的正常采食量，僅給予大鼠含相應(yīng)劑量薤白的高脂飼料量不能滿足其自由采食量，故筆者選擇分兩次給藥，即當(dāng)晚上大鼠開始活躍采食時，先按大鼠體質(zhì)量稱取相應(yīng)質(zhì)量的含藥高脂飼料給藥，待其食完，再補充未含藥的高脂飼料以滿足其1 d的正常采食量，以此方式給藥可以保證大鼠攝入薤白劑量的準(zhǔn)確性。

近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)引起高脂血癥的主要原因是血液中脂質(zhì)運轉(zhuǎn)或代謝紊亂，主要分為三類：高TC癥、高TG癥和兩者皆升高的混合型[8-9]。本研究結(jié)果表明，薤白可以明顯降低高脂血癥模型大鼠血清中TC含量，起到降血脂的作用。關(guān)于其對TG的作用，由于模型組與對照組比較TG水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此無法判斷薤白是否有降TG的功效。相關(guān)報道提示，高脂飼料只能形成高TC癥模型，脂肪乳有利于形成高TG癥模型[10-11]，因此有關(guān)薤白對TG的作用本課題組后續(xù)將采用脂肪乳造模后作進(jìn)一步研究。而對于陽性藥物的設(shè)置，根據(jù)降血脂藥物的藥理作用同樣分為三類：降TC類、降TG類和降混合型高脂血癥類藥物。在研究設(shè)計之初，暫未明確本研究藥物針對哪一類高脂血癥效果明顯，故暫未設(shè)置陽性對照組，本課題組將在此次研究基礎(chǔ)上，選擇相應(yīng)的陽性藥物繼續(xù)進(jìn)行考察。

臟器指數(shù)結(jié)果提示，飼喂高脂飼料后大鼠肝指數(shù)顯著升高，這與Liu CH等[12]的研究結(jié)果相符，當(dāng)長期飼喂高膽固醇飲食后，會引起肝腫大，故肝指數(shù)升高也可證明高脂模型造模成功。有研究表明，脾可能通過干擾肝內(nèi)脂蛋白受體在脂質(zhì)代謝中起重要作用[13]。飼喂薤白后，肝、脾指數(shù)下降明顯，表明薤白具有降血脂、保護(hù)肝脾的作用。而腎、心臟指數(shù)沒有明顯變化，可能是因為在造模時間內(nèi)還不足以引起腎和心臟質(zhì)量的明顯改變。

LDLR是細(xì)胞表面的一種糖蛋白，主要在肝合成。LDL-C是TC在體內(nèi)存在的主要形式，其可以結(jié)合LDLR后通過網(wǎng)格蛋白依賴途徑進(jìn)入細(xì)胞，釋放LDL-C及其負(fù)載的TC，達(dá)到減少TC含量的作用[14]。當(dāng)LDLR的數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能異常時，會導(dǎo)致TC含量升高，并在組織內(nèi)沉積，進(jìn)而導(dǎo)致各種心血管疾病的發(fā)生[15]。本研究結(jié)果提示，薤白可通過上調(diào)高脂血癥模型大鼠肝組織中LDLR mRNA表達(dá)，激活體內(nèi)膽固醇代謝通路，降低TC含量，進(jìn)而起到降血脂的作用。LXRs因其在肝中高表達(dá)又被稱為肝X受體，是存在于細(xì)胞核內(nèi)具有基因調(diào)控作用的核受體超家族成員，其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)尤其是膽固醇平衡中具有重要作用?，F(xiàn)研究主要有LXRα和LXRβ兩種亞型，分布于不同組織中，LXRα在肝組織中高表達(dá)，在其他組織（如脂肪、小腸等）也有表達(dá)；LXRβ在體內(nèi)各組織中分布廣泛，但均呈低水平表達(dá)。其中LXRα被稱為TC的感受器，激活后可抑制腸上皮細(xì)胞對膽固醇的吸收，增加膽固醇外流，促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化成膽汁酸[16]，故LXRα水平的高低可反映TC的代謝水平。本研究結(jié)果提示，薤白可通過上調(diào)高脂血癥模型大鼠肝組織中LXRα mRNA的表達(dá)，促進(jìn)TC代謝和排泄，降低TC含量，進(jìn)而起到降血脂的作用。

綜上所述，薤白可能通過上調(diào)肝組織中LDLR、LXRα mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮其降血脂的作用。但是，本研究僅初步探討了薤白的降血脂作用及機(jī)制，其更多的作用機(jī)制以及具體是哪種成分起作用等問題均需要進(jìn)一步深入研究。

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（收稿日期：2017-11-16 修回日期：2018-01-31）

（編輯：林 靜）