黃芪—當(dāng)歸配伍對(duì)大鼠血管內(nèi)膜增生模型細(xì)胞外基質(zhì)的影響

彭熙煒　閻卉芳　黃娟　朱嘉歡　徐昊　黃小平　鄧常清

〔摘要〕 目的 研究黃芪和當(dāng)歸配伍對(duì)大鼠血管內(nèi)膜增生血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為黃芪與當(dāng)歸（簡(jiǎn)稱芪歸）1∶1、芪歸5∶1（3.9 g/kg）配伍組及單用黃芪組（2.17 g/kg）、單用當(dāng)歸組（1.08 g/kg）、陽(yáng)性藥物阿托伐他汀對(duì)照組（0.1 g/kg）和假手術(shù)組，采用球囊導(dǎo)管損傷大鼠血管內(nèi)皮造成胸腹主動(dòng)脈血管內(nèi)膜增生模型，同時(shí)灌胃黃芪、當(dāng)歸不同比例配伍藥物，連續(xù)給藥14 d后，取胸腹主動(dòng)脈，用western blot法檢測(cè)增生內(nèi)膜中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)增生內(nèi)膜中Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、纖維聯(lián)接蛋白（FN）表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，單用當(dāng)歸組、芪歸1∶1組、阿托伐他汀組Col-Ⅰ、FN、MMP-9表達(dá)顯著降低（P<0.01，P<0.05）。芪歸5∶1組Col-Ⅰ、MMP-9表達(dá)強(qiáng)度顯著低于模型組（P<0.05）；單用黃芪組MMP-9表達(dá)強(qiáng)度顯著低于模型組（P<0.05）。單用黃芪組Col-Ⅰ、FN的表達(dá)強(qiáng)度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），芪歸5∶1組FN的表達(dá)強(qiáng)度與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各組間TIMP的表達(dá)強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 黃芪-當(dāng)歸配伍可抑制血管內(nèi)膜增生時(shí)血管壁細(xì)胞外基質(zhì)沉積，其中當(dāng)歸為其主要的效應(yīng)藥物，黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍的作用強(qiáng)于兩藥單用及其5∶1配伍。

〔關(guān)鍵詞〕 黃芪；當(dāng)歸；配伍；血管內(nèi)膜增生；細(xì)胞外基質(zhì)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5；R393；R54 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.005

〔Abstract〕 Objective To study the effect of compatibility of Astragali Radix （Huangqi） and Angelicae Sinensis Radix （Danggui） on the extracellular matrix of rats with intima hyperplasia. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into different groups： Huangqi-Danggui 1∶1 group， Huangqi-Danggui 5∶1 group （3.9 g/kg）， Huangqi group （2.17 g/kg）， Danggui group （1.08 g/kg）， atorvastatin control group （0.1g/kg） and sham-operation group. A model of intimal hyperplasia of thoracoabdominal aorta was established by balloon catheter injury in rats. Then thoracoabdominal aorta was taken out after administration of Huangqi and Danggui for 14 days. The expression of matrix metallopeptidase-9 （MMP-9） and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 （TIMP-1） in proliferating endometrium was detected by Western blot. Immunohistochemistry was used to detect the expression of collagen-Ⅰ（Col-Ⅰ） and fibronectin （FN） in proliferative endometrium. Results Compared with the model group， the expression intensity of Col-Ⅰ， FN and MMP-9 in Danggui group， Danggui-Huangqi 1∶1 group， atorvastatin group were significantly lower （P<0.01， P<0.05）. The expression of Col-I and MMP-9 in Danggui-Huangqi 5∶1 group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. The expression of MMP-9 in Danggui group was significantly lower than that in model group （P<0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of Col-Ⅰand FN between the Danggui group and the model group （P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of FN between the Huangqi-Danggui 5∶1 group and the model group（P>0.05）. There was no significant difference in the expression intensity of TIMP between each group（P>0.05）. Conclusion Huangqi and Danggui could inhibit the deposition of extracellular matrix during intimal hyperplasia. And Danggui is one of the main effect drugs. The effect of Huangqi-Danggui 1∶1 compatibility was stronger than the two drugs alone and compatibility of Huangqi-Danggui 5∶1.

〔Keywords〕 Astragali Radix； Angelicae Sinensis Radix； compatibility； vascular intimal hyperplasia； extracellular matrix

血管內(nèi)膜增生是動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓血管重構(gòu)和介入術(shù)后血管再狹窄等心血管疾病的病理生理基礎(chǔ)。在其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制中，血管內(nèi)皮損傷后導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）從血管中膜遷移到內(nèi)膜并增殖是其病理生理基礎(chǔ)。同時(shí)，VSMC在內(nèi)膜遷移增殖過(guò)程中合成大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM），沉積于血管壁，從而形成新生內(nèi)膜，引起血管狹窄[1]。因此，抑制血管內(nèi)皮損傷后VSMC增殖的同時(shí)，抑制ECM沉積和促進(jìn)其降解，是防治血管內(nèi)膜增生性病變的重要手段。

黃芪和當(dāng)歸是臨床常用的中藥藥對(duì)，二者配伍既具有補(bǔ)氣生血作用，又可益氣活血。黃芪和當(dāng)歸的配伍（簡(jiǎn)稱芪歸）應(yīng)用最有名的是公元1247年由李東垣所創(chuàng)的當(dāng)歸補(bǔ)血湯（Danggui Buxue Tang， DBT），由黃芪一兩、當(dāng)歸二錢組成，芪歸比為5∶1。研究表明，由黃芪和當(dāng)歸配伍組方除具有促進(jìn)造血[2]、增強(qiáng)免疫力[3]等作用外，還具有心血管保護(hù)作用[4]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[5]等藥理效應(yīng)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪-當(dāng)歸在一定比例范圍內(nèi)配伍有較好的抗血管內(nèi)膜增生的作用，而且當(dāng)歸為其抗血管內(nèi)膜增生的主要藥效物質(zhì)。黃芪配伍當(dāng)歸可增強(qiáng)其抗血管內(nèi)膜平生的作用，其中以芪歸1∶1配伍的作用為強(qiáng)[6]，但其作用機(jī)制尚未闡明。因此，我們基于血管內(nèi)膜增生的病理生理機(jī)制，以抑制ECM沉積為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討了黃芪和當(dāng)歸配伍抗血管內(nèi)膜增生的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

2.0 mm×15 mm Runjin醫(yī)用球囊導(dǎo)管、Runthrough導(dǎo)絲（日本泰爾茂株式會(huì)社產(chǎn)品）。醫(yī)用球囊擴(kuò)張壓力泵（江西省中醫(yī)院提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD雄性大鼠，體質(zhì)量220～250 g，SPF級(jí)，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，大鼠動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0004。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，濕度45%～65%、室溫25 ℃，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由攝水。實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地許可證號(hào)：SCXK（湘）2013-0005。

1.3 藥物及制備

黃芪（產(chǎn)地內(nèi)蒙古）、當(dāng)歸（產(chǎn)地甘肅）由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一購(gòu)進(jìn)并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)附一醫(yī)院左亞杰教授鑒定，黃芪為膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.） Bunge的干燥根，當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis （Oliv.） Diels的干燥根。根據(jù)本課題組以前的研究結(jié)果，黃芪和當(dāng)歸在1∶1配伍時(shí)具有較好的抑制血管內(nèi)膜增生的作用[6]，而黃芪和當(dāng)歸的傳統(tǒng)配伍是5∶1，故設(shè)立黃芪-當(dāng)歸1∶1、5∶1配伍及單用藥物組。按不同配伍，分別稱取藥材，以水熱回流法提取3次（第一次8倍量水，提取1 h；第二、三次6倍量水，提取1 h），合并3次提取液，過(guò)濾后在60 ℃真空條件下蒸發(fā)濃縮制成浸膏，取出浸膏用蒸餾水定容為一定濃度：黃芪0.22 g/mL（生藥）、當(dāng)歸0.11 g/mL（生藥）、芪-歸不同配伍組0.39 g/mL（生藥）。藥液中加入苯甲酸鈉0.1%，分裝后置-4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩０⑼蟹ニ♀}，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：20160803，規(guī)格：10 mg/片。臨用時(shí)用蒸餾水溶解制成混懸液。

1.4 主要試劑

兔抗大鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）多克隆抗體、兔抗大鼠組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）多克隆抗體、兔抗大鼠Ⅰ型膠原（Col-I）多克隆抗體、兔抗大鼠纖維聯(lián)接蛋白（FN）多克隆抗體、β-actin多克隆抗體為英國(guó)abcam公司產(chǎn)品。DAB顯色試劑盒（批號(hào)：SP-900D）、免疫組化染色試劑盒（批號(hào)：SP-9001）為北京中杉金橋生物有限公司產(chǎn)品。牛血清蛋白（BSA）為華美生物工程有限公司產(chǎn)品。PVDF膜為瑞典Amersham公司產(chǎn)品。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒為美國(guó)GE Healthcare公司產(chǎn)品。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備方法

將大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組、模型組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組、芪歸5∶1組、阿托伐他汀組。每組實(shí)驗(yàn)成功的大鼠數(shù)為8～10只。采用球囊損傷后血管再狹窄模型[7]。假手術(shù)組∶只分離暴露左頸總動(dòng)脈后縫合，不進(jìn)行球囊損傷術(shù)。術(shù)后灌服等量蒸餾水。模型組∶行胸腹主動(dòng)脈球囊損傷造模，不進(jìn)行藥物干預(yù)。術(shù)后灌服等量蒸餾水。阿托伐他汀組∶胸腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后灌服阿托伐他汀藥液。芪歸不同配比組∶胸腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后灌服芪歸不用配比藥液。術(shù)后第一天開始給藥，連續(xù)14 d后檢測(cè)。給藥劑量為∶單用當(dāng)歸組1.1 g/kg，單用黃芪組2.2 g/kg，芪歸配伍組3.9 g/kg（芪歸1∶1配伍為1.95 g/kg+1.95 g/kg，芪歸5∶1配伍為3.25 g/kg+0.65 g/kg），阿托伐他汀組10 mg/kg。給藥體積為10 mL/kg。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 標(biāo)本的采集 末次給藥后次日麻醉動(dòng)物，截取胸腹主動(dòng)脈血管。用于western blot檢測(cè)的血管直接放入凍存管，然后置于-80 ℃冰箱保存。用于免疫組化檢測(cè)的血管以4%多聚甲醛固定，置于4 ℃冰箱保存。

2.2.2 免疫組織化學(xué)法測(cè)定增生內(nèi)膜中FN、Col-I表達(dá) 以免疫組織化學(xué)法測(cè)定增生內(nèi)膜中FN、Col-I的表達(dá)（一抗稀釋倍數(shù)∶FN 1∶100，Col-I 1∶100），操作按說(shuō)明書。光鏡下可見陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色點(diǎn)狀或纖維狀染色，集中在細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或細(xì)胞間。陰性則無(wú)棕黃色染色。用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)拍照，再每張切片分別選取3個(gè)不同視野，用image-pro plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量單位面積的陽(yáng)性染色積分光密度（integrated optical density，IOD），取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.3 western blot法測(cè)定MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá) 取出血管組織，剔除外膜結(jié)締組織，盡量剪碎，加入1 mL的RIPA裂解液，2 μL PMSF，研磨至無(wú)明顯的組織碎片，再置于冰上0.5 h后，將組織勻漿液移至1.5 mL的離心管中，于4 ℃ 10 000 r/min離心10 min，取上清液。以BCA法測(cè)定樣品的蛋白含量。按配方制備10%聚丙烯酰胺分離膠和5%聚丙烯酰胺濃縮膠，將凝膠轉(zhuǎn)移至電泳槽。取樣品蛋白，加入2×SDS loading buffer、β-巰基乙醇、裂解液調(diào)整蛋白濃度（1 μg/μL），置沸水中煮10 min使蛋白變性。將待分析樣品和Marker依次加入，每個(gè)泳道加入20 μL。然后進(jìn)行電泳。電泳完畢后，將凝膠放在電轉(zhuǎn)液中，恒流20 mA轉(zhuǎn)膜，4 ℃冰箱中過(guò)夜，使凝膠目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用PBS液洗2次，然后放入5%PBS-脫脂奶粉封閉液內(nèi)封閉90 min。將PVDF膜放入雜交袋中，加入約1 mL一抗（MMP-9 1∶1 000， TIMP-l l∶1 000， β-actin 1∶1 000），在室溫下?lián)u床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。再將上述與一抗孵育的PVDF膜加入稀釋的二抗（羊抗兔IgG 1∶1 000），在室溫下?lián)u床（70 r/min）孵育90 min。PBS洗3次，每次10 min。以ECL顯色液顯色，最后用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。用Quantity One圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的累積光密度（integrated optical density，IOD），以目的條帶的IOD與β-actin條帶的IOD的比值作為該目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“x±s”表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett's T3檢驗(yàn)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3 結(jié)果

3.1 各組增生內(nèi)膜中Col-Ⅰ、FN表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組增生內(nèi)膜Col-Ⅰ表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組增生內(nèi)膜Col-Ⅰ表達(dá)強(qiáng)度顯著降低（P<0.01）；單用當(dāng)歸組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組增生內(nèi)膜Col-Ⅰ表達(dá)強(qiáng)度也顯著低于模型組（P<0.05）；單用黃芪組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各藥物組之間增生內(nèi)膜Col-Ⅰ表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1、圖1。

與假手術(shù)組比較，模型組增生內(nèi)膜FN表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）。與模型組比較，阿托伐他汀組、單用當(dāng)歸組增生內(nèi)膜FN表達(dá)強(qiáng)度顯著降低（P<0.01）；芪歸1∶1組也較模型組FN表達(dá)強(qiáng)度降低（P<0.05）；單用黃芪組、芪歸5∶1組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。各藥物組之間增生內(nèi)膜FN表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1、圖2。

3.2 各組MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)的比較

與假手術(shù)組比較，模型組MMP-9蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)（P<0.01）。與模型組比較，單用黃芪組MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度低于模型組（P<0.05）；阿托伐他汀組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組MMP-9蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著低于模型組（P<0.01）。各藥物組之間MMP-9蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

與假手術(shù)組比較，模型組TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著差異（P>0.05）。與模型組比較，阿托伐他汀組、單用當(dāng)歸組、單用黃芪組、芪歸1∶1組和芪歸5∶1組TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度無(wú)明顯差異（P>0.05）。各藥物組之間TIMP-1蛋白表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著差異（P>0.05）。見表2、圖3。

4 討論

ECM是分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子， 主要由多糖、蛋白質(zhì)或蛋白聚糖等組成。ECM在維持血管壁的完整性和血管壁細(xì)胞的正常功能中扮演著重要的角色。在動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等病變中ECM與VSMC的相互作用是其重要的病理因素。血管內(nèi)膜增生性疾病中，血管中膜的VSMC增殖并遷移至內(nèi)膜后合成大量ECM并在血管壁沉積，從而進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)膜的增生。層黏連蛋白、彈性蛋白、膠原和纖維連接蛋白等是ECM的主要組成成分，其中膠原占據(jù)大部分，以Ⅰ型和Ⅲ膠原為主[8]。Nikkari等[9]研究表明，血管內(nèi)皮損傷第3天起增加最明顯的是Ⅰ型膠原，2周達(dá)高峰后便逐漸下降。在增生的血管內(nèi)膜中，可見ECM大量沉積，主要成分是纖維聯(lián)接蛋白和膠原，占據(jù)了89%，僅有11%為細(xì)胞成分，ECM的沉積促進(jìn)了VSMC的增殖與向內(nèi)膜的遷移[10]。

另外在ECM的合成與降解過(guò)程中基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMPs）起著另一關(guān)鍵的作用。目前發(fā)現(xiàn)的MMPs有20種之多，其中對(duì)膠原的合成與降解起著關(guān)鍵作用的為MMP-2與MMP-9等。在正常情況下組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitormatrix metallo proteinase，TIMPs）對(duì)MMPs的代謝起抑制作用，目前已發(fā)現(xiàn)四種TIMPs對(duì)MMPs有著顯著的抑制作用，即為：TIMP-l、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4。TIMPs抑制MMPs的機(jī)制是其與MMPs以1∶1的比例非共價(jià)結(jié)合。在介入術(shù)后血管內(nèi)皮損傷，TIMPs的合成與表達(dá)可以抑制血管內(nèi)膜增生，其機(jī)制是可抑制VSMC的增殖與遷移，并能誘導(dǎo)VSMC凋亡[11]。Southgate等[12]研究發(fā)現(xiàn)：在行豬冠狀動(dòng)脈剝脫術(shù)后，MMP-2、MMP-9在術(shù)后第3天的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并且其表達(dá)強(qiáng)度能維持21 d不衰減。有研究發(fā)現(xiàn)[13]MMPs抑制劑能有效抑制新生的血管內(nèi)膜形成，在球囊血管損傷造模后即開始給予MMPs抑制劑，可見術(shù)后1周內(nèi)ECM成分中膠原的合成明顯減少33%。因此，在血管增殖性病變的防治中，抑制ECM的過(guò)度沉積，對(duì)于其防治具有重要的治療學(xué)意義。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在血管損傷模型大鼠，三七總皂苷能顯著降低增生內(nèi)膜中纖維聯(lián)接蛋白（FN）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)，從而抑制ECM在內(nèi)膜中的沉積并降解ECM相關(guān)蛋白，達(dá)到抑制血管內(nèi)膜增生的作用。有研究發(fā)現(xiàn)[7]：補(bǔ)陽(yáng)還五湯能抑制纖維聯(lián)接蛋白（FN）、膠原Ⅰ（Col-Ⅰ）的表達(dá)，降解ECM相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制ECM在血管壁的沉積。張偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)陽(yáng)還五湯中生物堿和苷能顯著抑制ECM的沉積，其作用機(jī)制是通過(guò)抑制Col-Ⅰ及 FN的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。因此，抑制ECM在血管內(nèi)膜中的沉積是防治血管增殖性病變的重要靶點(diǎn)。中醫(yī)藥具有多環(huán)節(jié)多靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)作用，可能通過(guò)調(diào)節(jié)ECM代謝而發(fā)揮其抗血管內(nèi)膜增生的作用。

本研究表明，球囊導(dǎo)管損傷血管內(nèi)膜后，可造成明顯的血管內(nèi)膜增生。增生內(nèi)膜中細(xì)胞外基質(zhì)成分Col-Ⅰ、FN表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明在增生血管內(nèi)膜中ECM合成增加，進(jìn)一步促進(jìn)了VSMC增殖和內(nèi)膜的增生。阿托伐他汀、單用當(dāng)歸、芪歸1∶1配伍可抑制增生內(nèi)膜中Col-Ⅰ、FN的表達(dá)。提示當(dāng)歸及黃芪-當(dāng)歸配伍可抑制ECM在增生內(nèi)膜中的沉積，從而減輕血管內(nèi)膜增生的程度。研究還發(fā)現(xiàn)，單用黃芪對(duì)Col-Ⅰ、FN表達(dá)無(wú)明顯抑制作用，芪歸5∶1組能抑制Col-Ⅰ的表達(dá)，但對(duì)FN表達(dá)無(wú)明顯抑制作用。表明單用黃芪對(duì)血管內(nèi)膜中ECM沉積無(wú)顯著影響，芪歸5∶1配伍抑制ECM沉積的作用弱于1∶1配伍。

一般認(rèn)為，MMP-9表達(dá)增強(qiáng)可促進(jìn)ECM的降解，TIMP表達(dá)增強(qiáng)可抑制ECM的降解。本研究發(fā)現(xiàn)在球囊損傷模型，血管MMP-9表達(dá)增強(qiáng)，而TIMP-1則無(wú)明顯變化。這與血管損傷時(shí)，通過(guò)誘導(dǎo)MMP-9基因表達(dá)及促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌MMP-9有關(guān)，使得MMP與TIMP之間的平衡被破壞[16]。MMP-9的大量表達(dá)雖然可以促進(jìn)ECM的降解，但其同時(shí)催化降解VSMC周圍的基底膜，使之與周圍的基質(zhì)接觸，促使VSMC表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂羞w移和增生能力的分泌型VSMC，并且ECM的降解使得中膜VSMC得以擺脫ECM的束縛，加速了VSMC的遷移，從而促進(jìn)血管內(nèi)膜增生[17]。另外MMP-9的大量表達(dá)可促進(jìn)脂蛋白向內(nèi)膜下沉積及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，可導(dǎo)致斑塊形成，加速內(nèi)膜增生[18]。所以抑制MMP-9的表達(dá)可起到穩(wěn)定斑塊、抑制VSMC增殖與遷移的作用。本研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀、黃芪、當(dāng)歸、芪歸1∶1及芪歸5∶1配伍對(duì)MMP-9的表達(dá)有明顯的抑制作用，表明其能通過(guò)抑制MMP-9的表達(dá)而達(dá)到糾正ECM清除機(jī)制失衡、抑制VSMC增殖與遷移及穩(wěn)定斑塊的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，單用黃芪對(duì)MMP-9的表達(dá)抑制作用較弱，說(shuō)明黃芪并非抑制MMP-9表達(dá)的主要藥物，但黃芪和當(dāng)歸配伍可增強(qiáng)其抑制MMP-9表達(dá)的作用。

總之，單用當(dāng)歸、芪歸1∶1配伍可抑制增生內(nèi)膜中ECM沉積，從而抑制VSMC遷移增殖。在黃芪-當(dāng)歸配伍中，當(dāng)歸為其主要的效應(yīng)藥物，黃芪-當(dāng)歸1∶1配伍的作用強(qiáng)于5∶1。

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（本文編輯 楊 瑛）