多指標(biāo)正交試驗優(yōu)化大黃的濕紙煨制工藝

張志 李聽弦 姚楠 謝婧 王光忠

中圖分類號 R283 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0964-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.24

摘 要 目的：優(yōu)化大黃的濕紙煨制工藝。方法：以煨制后大黃的外觀性狀、浸出物含量、總蒽醌含量、游離蒽醌含量、結(jié)合蒽醌含量、番瀉苷A+番瀉苷B含量等多個指標(biāo)的加權(quán)綜合評分值為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗對用紙量、煨制時間、 煨制溫度3個因素進行考察，優(yōu)化大黃的濕紙煨制工藝，并進行驗證試驗。結(jié)果：優(yōu)化的大黃煨制工藝為每100 g大黃用紙12 g包裹、120 ℃炮制2 h。驗證試驗及中試試驗結(jié)果顯示，煨制后大黃的綜合評分均值分別為84.99（RSD<2.0%，n=3）、85.06（RSD<2.5%，n=3）。結(jié)論：優(yōu)化后的大黃煨制工藝簡便易行，重復(fù)性和可操作性好，本研究為煨大黃的規(guī)范化制備奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 大黃；濕紙煨制工藝；正交試驗；多指標(biāo)；加權(quán)評分法

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the wet paper roasting technology of Rheum palmatum. METHODS： Weighted comprehensive score composed of external properties of R. palmatum roasting with wet paper， the content of extract， total content of anthraquinone， free anthraquinones， conjugated anthraquinone and sennoside A+sennoside B， which were used as investigation indexes. L9 （34） orthogonal test was adopted to investigate the three factors as the amount of paper， roasting time and roasting temperature， and optimized wet paper roasting technology of R. palmatum. Validation test was conducted. RESULTS： The optimal roasting technology was as follows as 100 g R. palmatum covered with 12 g paper， processing at 120 ℃， for 2 h. The results of validation test and pilot test showed the average comprehensive scores of roasted R. palmatum were 84.99 （RSD<2.0%， n=3） and 85.06 （RSD<2.5%， n=3）， respectively. CONCLUSIONS： The optimal processing technology is simple and convenient with good reproducibility and operability. It lays a technical foundation for the standardized preparation of stewed R. palmatum.

KEYWORDS Rheum palmatum； Wet paper roasting technology； Orthogonal test； Multi-index； Weighted scoring method

大黃為蓼科植物掌葉大黃（Rheum palmatum L.）、唐古特大黃（Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.）或藥用大黃（Rheum officinale Baill.）的干燥根和根莖，其化學(xué)成分主要有蒽醌及其苷類、蒽酮及其苷類、二苯乙烯類、多糖類、鞣質(zhì)類等[1]，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的作用，可用于實熱積滯便秘、血熱吐衄、目赤咽腫、癰腫疔瘡、腸癰腹痛、瘀血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、跌打損傷、濕熱痢疾、黃疸尿赤、淋證、水腫等的治療，此外，還可外治燒燙傷。大黃炮制方法有多種，2015年版《中國藥典》（一部）記載的飲片有大黃、酒大黃、熟大黃和大黃炭。其中，酒大黃善清上焦血分熱毒，用于目赤咽腫、齒齦腫痛；熟大黃瀉下力緩、瀉火解毒，用于火毒瘡瘍；大黃炭涼血化瘀止血，用于血熱有瘀出血癥[2]。

為對古代應(yīng)用的特色炮制技術(shù)及飲片進行挖掘開發(fā)，筆者通過查找多種古籍文獻，發(fā)現(xiàn)記載有“濕紙裹煨”（唐·《顱囟》）、“紙裹煨，慢火煨候紙黃色住”（宋·《博濟方》）、“濕紙裹煨令香熟”（明·《普濟方》）等炮制方法[3]，表明煨大黃在古代應(yīng)用普遍，但具體方法及工藝不明。為此，本課題組在前期研究中結(jié)合實際操作情況，對同一批大黃的生飲片、無紙煨炮制品、干紙煨炮制品和濕紙煨炮制品的浸出物、主要成分含量進行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕紙煨炮制品優(yōu)于其他炮制品。在此基礎(chǔ)上，本研究選取濕紙作為輔料煨制大黃，以煨大黃的外觀性狀以及浸出物、總蒽醌、游離蒽醌、結(jié)合蒽醌、番瀉苷A+番瀉苷B的含量為指標(biāo)，通過多指標(biāo)正交試驗優(yōu)化大黃的濕紙煨制工藝，為煨大黃的規(guī)范化制備及臨床應(yīng)用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；KODUS超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；AL204萬分之一電子天平[瑞士梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Precisa 360 ES十萬分之一電子天平（上海精科天美科學(xué)儀器有限公司）；XL-04B密封型搖擺式粉碎機（廣州市旭朗機械有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市國華電器有限公司）；GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 藥材與試劑

大黃飲片購自湖北天濟中藥有限公司（批號：20161207），經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張秀橋教授鑒定蓼科植物掌葉大黃的干燥根和根莖；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、番瀉苷A、番瀉苷B對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號：160309、151016、151215、151010、151024、160310、151219，純度：均≥98%）；氯仿、磷酸、鹽酸、碳酸氫鈉等試劑均為分析純，甲醇、四氫呋喃為色譜純，水為重蒸水。

1.3 紙

桑皮紙，購于南陽高新區(qū)伏牛山野生艾條店。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

稱取大黃飲片100 g，以適量濕紙（紙-水=1 ∶ 2，m/m）夾住，以繩捆扎結(jié)實，放入烘箱中烘一定時間后取出，放涼，除去紙，依次制備得到煨制后大黃供試樣品。

2.2 外觀性狀評價

根據(jù)古籍中“濕紙裹煨令香熟” “紙裹煨，慢火煨候紙黃色住”等描述，對濕紙煨大黃的表面顏色、粉末顏色、附著物、質(zhì)地和氣味進行評分，各項指標(biāo)起評分為0.5分，滿分2.0分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

2.3 浸出物含量測定

按照2015年版《中國藥典》（四部）水溶性浸出物測定法（通則2201）項下的熱浸法[4]測定。

2.4 蒽醌類成分含量測定

測量指標(biāo)包括總蒽醌含量、游離蒽醌含量和結(jié)合蒽醌含量，其中總蒽醌含量和游離蒽醌含量均以蘆薈大黃素（C15H10O5）、大黃酸（C15H8O6）、大黃素（C15H10O5）、大黃酚（C15H10O4）和大黃素甲醚（C16H12O5）的總量計。

2.4.1 總蒽醌含量測定

（1）混合對照品溶液的制備。精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚各對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80 ?g和含大黃素甲醚40 ?g的溶液；分別精密量取上述對照品溶液各2 mL，混勻，即得（每1 mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 ?g，含大黃素甲醚8 ?g）。

（2）供試品溶液的制備。取煨制后大黃粉末（過四號篩）約0.15 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5 mL，置于錐形瓶中，揮去溶劑，再加8%鹽酸溶液10 mL，超聲（功率：100 W、頻率：53 kHz）2 min溶解，加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷至室溫，置于分液漏斗中，分取三氯甲烷層，剩余部分再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷提取溶液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗與方法學(xué)考察。本色譜條件參考文獻[2]。色譜柱：Kromasll C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85 ∶ 15， V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：254 nm。取本項下“（1）”和“（2）”中溶液進樣分析，理論板數(shù)以大黃素峰計應(yīng)不低于3 000；各待測成分峰與雜質(zhì)峰分離良好，兩峰間分離度分別為2.28、1.59、1.63、1.70、8.44；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚出峰時間依次為5.67、7.44、12.46、17.19、25.93 min；蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的定量限分別為0.450、0.705、0.331、0.311、1.047 ?g/mL（信噪比為10）；其余方法學(xué)考察結(jié)果均符合要求。

（4）測定方法。分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 ?L，注入液相色譜儀，測定。

2.4.2 游離蒽醌含量測定

（1）供試品溶液的制備。取煨制后大黃粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取1 h，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（2）測定方法。分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，注入液相色譜儀，按“2.4.1（3）”項下條件測定。

2.4.3 結(jié)合蒽醌含量測定

結(jié)合蒽醌含量=總蒽醌含量-游離蒽醌含量。

2.5 番瀉苷A、番瀉苷B含量測定

2.5.1 混合對照品溶液制備

取番瀉苷A和番瀉苷B對照品適量，精密稱定，置于棕色瓶中，加入0.1%碳酸氫鈉水溶液制成每1 mL含番瀉苷A為88 ?g、番瀉苷B為60 ?g的混合對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液制備

取煨制后大黃粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，加入0.1%碳酸氫鈉水溶液25 mL，超聲（功率：100 W、頻率：53 kHz）提取30 min，取上清液用微孔濾膜（0.45 ?m）濾過，即得。

2.5.3 色譜條件、系統(tǒng)適用性試驗與方法學(xué)考察

本色譜條件參考文獻[5-6]。色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：四氫呋喃-水-醋酸（17 ∶ 83 ∶ 1.5，V/V/V）；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：350 nm。取“2.5.1”項下和“2.5.2”項下溶液進樣分析，此條件下以番瀉苷B峰計理論板數(shù)不低于6 500；番瀉苷B、番瀉苷A的出峰時間分別為16.685、25.137 min，各峰與前雜質(zhì)峰分離度分別為2.80、2.90；番瀉苷A、番瀉苷B定量限分別為2.897、2.805 ?g/mL（信噪比為10）；其余方法學(xué)考察項目均符合要求。

2.5.4 含量測定方法

分別精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 ?L，注入液相色譜儀，按“2.5.3”項下條件測定。

2.6 多指標(biāo)加權(quán)評分法

采用多指標(biāo)加權(quán)評分法處理試驗數(shù)據(jù)：將外觀性狀得分最高、浸出物含量最高、總蒽醌含量最高、游離蒽醌含量最高的樣品分別定為100分，結(jié)合蒽醌含量最低、番瀉苷A+番瀉苷B含量最低的樣品分別定為100分，其余各次試驗的評價指標(biāo)依次換算成相應(yīng)的指標(biāo)分數(shù)（計算公式為a/b×100%，其中在前3個指標(biāo)中a為實際值，b為9個值中最大值；在后2個指標(biāo)中a為9個值中最小值，b為實際值）。其中，外觀性狀、浸出物含量、總蒽醌含量、游離蒽醌含量的權(quán)重系數(shù)均為20%，結(jié)合蒽醌含量和番瀉苷A+番瀉苷B含量的權(quán)重系數(shù)各為10%，將六者加權(quán)求得綜合評分（各指標(biāo)的指標(biāo)分數(shù)×權(quán)重系數(shù)之和）。

2.7 正交試驗優(yōu)化煨制工藝

采用L9（34）正交試驗對煨制工藝中的主要影響因素煨制溫度（A，℃）、煨制時間（B，h）、用紙量（C，100 g大黃用紙量，g） 進行考察。因素與水平見表2，正交試驗方案與結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，各因素對濕紙煨制大黃均有顯著影響。優(yōu)化的濕紙煨制工藝為A2B2C3，即每100 g大黃用12 g紙（水潤濕），120 ℃煨制2 h。

2.8 驗證試驗

取100 g大黃3份，按優(yōu)化工藝A2B2C3進行驗證試驗，結(jié)果總蒽醌含量均大于1.5%、游離蒽醌含量均大于0.5%，符合《中國藥典》要求[2]，綜合評分均值為84.99，且各指標(biāo)的RSD均小于2.0%（n=3），表明優(yōu)化的炮制工藝穩(wěn)定、合理、可行，制備出的大黃飲片質(zhì)量穩(wěn)定，詳見表5。

2.9 中試試驗

取500 g大黃按優(yōu)化的工藝進行中試試驗，由于工藝參數(shù)放大，將煨制時間增加至2.5 h。結(jié)果，總蒽醌含量均大于1.5%、游離蒽醌含量均大于0.5%，符合《中國藥典》要求[2]，綜合評分均值為85.06，且各指標(biāo)的RSD均小于2.5%（n=3），表明優(yōu)化的工藝能模擬工業(yè)化生產(chǎn)，詳見表6。

3 討論

在藥材炮制工藝中，輔料及其用量、炮制時間、炮制溫度是最重要的3個因素，因此在煨大黃的試驗中，在已選定桑皮紙的情況下，確定用紙量、煨制時間、煨制溫度為正交試驗因素。在筆者進行正式試驗前進行的3因素水平選擇的預(yù)試驗中，發(fā)現(xiàn)完全能包裹住飲片的用紙量最低為4 g，因此選擇了4、8、12 g 3個用紙量水平。另查找相關(guān)文獻[7]并結(jié)合實際，選定了煨制溫度和時間的3個水平。

煨法是中藥炮制中歷史悠久的方法之一，并且一直沿用至今。目前，各地的《炮制規(guī)范》中都敘述了煨法的操作過程[8-10]，但沒有煨制大黃的記載，甚至有些古方劑中的煨大黃也被改成了酒大黃。煨大黃在古代的應(yīng)用普遍，記載煨制大黃的古籍多達10余部，如“去粗皮酒浸二三時，紙裹火煨”（元·《瑞竹》）“醋浸濕紙裹煨過切”（元·《寶鑒》、明·《準(zhǔn)繩》）“小便浸七日，日一易，以濕紙煨切焙”（宋·《蘇沈》）等[4]。其中，對大黃煨制的目的也有論述，如“大黃恐寒則損胃氣，須煨”（元·《湯液》） “苦寒酒煨引苦性上行至巔，驅(qū)熱而下以為使也”（明·《奇效》）。煨大黃在古方中的應(yīng)用有三黃瀉心湯（治積熱蘊隆三焦，大小便秘）、大黃左經(jīng)湯（治四氣流注足陽明經(jīng)，兩腳赤腫，痛不可行，大小便秘，惡聞食臭，喘滿自汗[11]）、瀉青丸（治肝熱抽搐，脈洪大而實）、香瓜丸（治遍身汗出）和三黃丸（治諸熱[12]）等，作用均為清熱解毒、瀉下通便?？梢?，本試驗對煨大黃的工藝開展研究，可為大黃這一應(yīng)用歷史悠久的炮制品的挖掘利用奠定基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的質(zhì)量評價指標(biāo)——外觀性狀是中藥經(jīng)歷代炮制后經(jīng)驗總結(jié)，是單一化學(xué)成分或化學(xué)部位不能替代的評價標(biāo)準(zhǔn)，因此本研究選其作為正交試驗的主要評價指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)設(shè)為20%；蒽醌類成分是大黃的主要有效成分之一，具有抗菌、抗炎、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、改善學(xué)習(xí)記憶能力、防護肝損傷等藥理作用[13]，故將總蒽醌含量、游離蒽醌含量的權(quán)重系數(shù)均設(shè)為20%。從煨大黃所載經(jīng)方的適應(yīng)病癥推斷，煨制大黃大多是為了緩和藥性以適合小兒、產(chǎn)婦等用藥或其他[12，14]，再有現(xiàn)代藥理學(xué)研究早已確認，大黃的致瀉成分為結(jié)合蒽醌和番瀉苷類化合物，游離蒽醌基本無致瀉作用[15]，可以推斷煨制大黃的用藥目的中有降低結(jié)合蒽醌含量以緩和瀉下的作用，故將結(jié)合蒽醌含量作為考察指標(biāo)，一方面結(jié)合蒽醌含量是考察大黃炮制品的一個重要指標(biāo)，是大黃峻瀉作用的主要成分，煨大黃是大黃的其中一種炮制品，主要目的是緩和藥性，希望煨制后其含量降低；另一方面總蒽醌含量和游離蒽醌含量為越高越好，且不一定是總蒽醌含量和游離蒽醌含量越高，結(jié)合蒽醌含量就越低，因此將結(jié)合蒽醌含量作為考察指標(biāo)之一。大黃來源有多種，產(chǎn)地也各有不同[16]，致瀉成分番瀉苷A與番瀉苷B含量差異會很大，即使在本試驗的樣品中二者含量很少，也應(yīng)將其設(shè)為考察指標(biāo)之一。從表3中可以看出，大黃煨制時，隨時間的增加，結(jié)合蒽醌、番瀉苷A+番瀉苷B含量逐漸減少，兩者的變化在一定范圍內(nèi)可以表明煨制大黃的程度，故將結(jié)合蒽醌含量與番瀉苷A+番瀉苷B含量的權(quán)重系數(shù)設(shè)為20%，分別為10%，并以含量最低者為100分。評分時以各指標(biāo)最優(yōu)值為參照，將數(shù)據(jù)歸一化，再通過不同的權(quán)重予以評價，最后結(jié)果表明優(yōu)化的工藝參數(shù)經(jīng)過驗證具有可行性和穩(wěn)定性。

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（收稿日期：2017-06-15 修回日期：2017-08-05）

（編輯：劉 萍）