基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒VP7蛋白合成肽抗體的制備及應(yīng)用

劉世旭　王慶　常藕琴　周文禮

摘要：【目的】制備基因I型草魚(yú)呼腸孤病毒（GCRV）VP7蛋白合成肽抗體并驗(yàn)證其特異性，為研究VP7外衣殼蛋白在基因I型GCRV病毒與宿主間的相互作用及研制基因工程疫苗提供參考依據(jù)。【方法】以GCRV GZ1208株為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，運(yùn)用在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)VP7蛋白B細(xì)胞表位進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，選擇位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列進(jìn)行人工合成，與鑰孔血藍(lán)蛋白載體蛋白偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔以獲得VP7蛋白合成肽抗體，然后采用Western blotting和間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證VP7蛋白合成肽抗體對(duì)基因I型GCRV的特異性識(shí)別能力。【結(jié)果】VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守，其合成肽抗體效價(jià)約1∶256000。Western blotting分析結(jié)果顯示，融合蛋白VP7約在55 kD處出現(xiàn)單一的特異性條帶，而GZ1208株和JX0901株樣品約在30 kD處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致；間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果表明，VP7蛋白合成肽抗體可特異性識(shí)別感染基因I型GCRV的草魚(yú)腦細(xì)胞（GCB），感染細(xì)胞中出現(xiàn)特異性綠色熒光信號(hào)，而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB細(xì)胞中均無(wú)特異性綠色熒光出現(xiàn)?！窘Y(jié)論】制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體能特異性識(shí)別基因I型GCRV，而不識(shí)別其他基因型毒株，可用于草魚(yú)出血病的臨床診斷和基因I型GCRV的病原學(xué)研究。

關(guān)鍵詞： 草魚(yú)呼腸孤病毒（GCRV）；基因I型；VP7蛋白；原核表達(dá)；合成肽抗體

中圖分類號(hào)： S943.112 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2018）09-1849-09

0 引言

【研究意義】草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）是我國(guó)最重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)，其產(chǎn)量約占全國(guó)淡水魚(yú)生產(chǎn)總量的20%（Rao and Su，2015），除西藏和青海呈零星養(yǎng)殖外，在我國(guó)其他各地均有一定規(guī)模養(yǎng)殖。據(jù)全國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，2014年我國(guó)草魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)506.99萬(wàn)t，2015年576.62萬(wàn)t，2016年589.88萬(wàn)t，其產(chǎn)值多年以來(lái)均穩(wěn)居我國(guó)淡水魚(yú)養(yǎng)殖首位。草魚(yú)在全球40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)均有分布（Dong et al.，2012），但隨之而來(lái)的病害日趨頻發(fā)，尤其是出血病嚴(yán)重阻礙了草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（Brudeseth et al.，2013）。草魚(yú)出血病主要由草魚(yú)呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）引起，是我國(guó)分離鑒定的第一例水生病毒（Zhang et al.，2008），且該病毒致病力強(qiáng)、傳染性高（Lu et al.，2011），一旦感染可導(dǎo)致草魚(yú)苗大量死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，加強(qiáng)GCRV的致病機(jī)理及其防治措施研究，對(duì)確保草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】GCRV是研究水生呼腸孤病毒復(fù)制和發(fā)病機(jī)理的代表病毒（He et al.，2011），其基因組由11個(gè)雙鏈RNA節(jié)段（S1～S11）組成，無(wú)囊膜，呈20面體的球狀顆粒（Ye et al.，2012）。目前，已報(bào)道GCRV擁有40多個(gè)分離株，包括854、861、873、875、876、90l4 、991、V、 H-962、ZV-8802、854、HZ08、JX09-01、JX09-02、GD108、104、106、109、Hunan1307和GZ1208等分離株，且不同分離株在致細(xì)胞病變、毒力、基因組電泳帶型、基因組序列和特征等方面存在明顯差異（Wang et al.，2012；Ye et al.，2012；Fan et al.，2013）。根據(jù)基因組差異，GCRV可分為3種基因型（Wang et al.，2012），其中873、HZ08、104分離株分別為基因I、II和III型的代表株（曾偉偉等，2017）。不同基因型GCRV感染草魚(yú)后引起的癥狀不完全相同，對(duì)草魚(yú)的致病率和致死率也不相同（張敏利等，2018）。其中，基因I型GCRV的S10節(jié)段編碼蛋白與銀大馬哈魚(yú)呼腸孤病毒（Coho salmon reovirus，SCSV）和條紋鱸呼腸孤病毒（Striped bass reovirus，SBRV）S10節(jié)段編碼的外衣殼蛋白，以及哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒（Mammalian orthoreovirus，MRV）S4節(jié)段編碼的外衣殼蛋白同源性較高，具有相同的鋅指結(jié)構(gòu)和相似的親水基團(tuán)分布情況，由此預(yù)測(cè)GCRV的S10節(jié)段基因編碼一種外衣殼蛋白（Liu et al.，2016）。Chen等（2013）研究證實(shí)，GCRV含7種結(jié)構(gòu)蛋白和4種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP7具有較好的抗原性。郝貴杰等（2010）以VP7基因?yàn)榘谢驑?gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并成功轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)；Luo等（2015）的抗體中和試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)，VP7是GCRV的主要抗原表位，為研制GCRV基因疫苗提供了參考資料。采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得重組蛋白再免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備多克隆抗體的方法較常見(jiàn)，但存在抗體特異性差、效價(jià)低的問(wèn)題。合成肽是以化學(xué)合成方法按蛋白氨基酸順序合成類似抗原表位的一種保護(hù)性短肽，與變性蛋白的結(jié)合性較高，抗原的特定區(qū)域能被合成肽識(shí)別（高華義等，2018）。合成肽屬于小分子物質(zhì)，以半抗原形態(tài)存在，很難在免疫動(dòng)物體內(nèi)引起有效的免疫反應(yīng)，因此必須耦聯(lián)載體蛋白（黃劍波，2016）。Tanzadehpanah等（2016）研究表明，以合成肽為抗原制備多克隆抗體，可降低抗原用量，且得到的多克隆抗體效價(jià)較高。【本研究切入點(diǎn)】GCRV GZ1208株分離自廣州某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病草魚(yú)，其S10節(jié)段全長(zhǎng)909 bp，含一個(gè)831 bp的開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼VP7外衣殼蛋白（分子量約30 kD），但至今未見(jiàn)針對(duì)VP7蛋白合成肽制備抗體的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以GCRV GZ1208株為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，運(yùn)用在線生物信息學(xué)分析軟件對(duì)VP7蛋白B細(xì)胞表位進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，選擇位于VP7蛋白第26～39位氨基酸的多肽序列進(jìn)行人工合成，與鑰孔血藍(lán)蛋白載體蛋白偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔以獲得VP7蛋白合成肽抗體，然后采用Western blotting和間接免疫熒光試驗(yàn)驗(yàn)證合成肽抗體對(duì)基因I型GCRV的特異性識(shí)別能力，為后續(xù)研究VP7外衣殼蛋白在基因I型GCRV病毒與宿主間的相互作用及研制基因工程疫苗提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

草魚(yú)腦細(xì)胞（GCB）及GCRV GZ1208株、JX09-01株、Hunan1307株、HZ08株、傳染性脾腎壞死病毒（ISKNV）、錦鯉皰疹病毒（KHV）由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所魚(yú)病室保存提供；GCRV 104株由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所曾令兵研究員惠贈(zèng)；pE-T32a（+）質(zhì)粒由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供；M199培養(yǎng)基、小牛血清（FBS）和胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α和BL21（DE3）、EcoR I酶、Xho I酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs及DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；T4 Ligase購(gòu)自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；SDS-PAGE試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgM購(gòu)自博士德生物工程有限公司。

1. 2 S10基因擴(kuò)增

根據(jù)GenBank上GCRV GZ1208株VP7外衣殼蛋白的編碼序列（KU240083.1）設(shè)計(jì)引物（5'-CCGGAA

TTCATGCCACTTCACATGATTCCGCAA-3'和5'-AC

GCTCGAGATCGGATGGCTCCACATGGCAAG-3'），下劃線部分分別為EcoR I和Xho I酶切位點(diǎn)；以GCRV GZ1208株感染GCB細(xì)胞，運(yùn)用Trizol法提取細(xì)胞RNA，RT-PCR擴(kuò)增目的片段。反應(yīng)體系25.00 μL：dNTPs 4.00 μL，GZ1208株cDNA模板2.00 μL，上、下游引物各0.50 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，LA Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O 15.25 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 35 s，65 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。反應(yīng)結(jié)束后回收純化擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 3 生物信息學(xué)分析

S10基因測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST分析，運(yùn)用DNASTAR和IEBD對(duì)VP7蛋白氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)。

1. 4 多肽合成及抗體制備

根據(jù)抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果，選擇位于VP7蛋白上第26～39位氨基酸的多肽序列（TKTRTETTNFDHAD）送至南京金斯瑞生物科技有限公司合成多肽，與鑰孔血藍(lán)蛋白載體蛋白KLH偶聯(lián)后免疫新西蘭白兔。參照王玉坤等（2008）、李麗等（2015）、宗乾坤等（2016）的方法收集血清制備抗體。

1. 5 間接ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)

采用pH 7.4的碳酸鹽緩沖液稀釋VP7蛋白合成肽（終濃度4 mg/mL）包被96孔酶標(biāo)板，每孔100.00 mL，分別按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000、1∶256000和1∶512000梯度加入血清抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5000倍稀釋）100.00 mL，其余步驟參照Mahajan等（2015）、Yu等（2015）、張玉瑤等（2015）、Andreolla等（2018）的方法進(jìn)行操作。

1. 6 表達(dá)載體構(gòu)建

擴(kuò)增獲得的S10基因目的片段與原核表達(dá)載體pET-32a（+）進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物在16 ℃下連接10～12 h，連接體系：T4 Ligase 0.50 μL，T4 Ligase Buffer 2.00 μL，pET-32a（+）2.00 μL，S10基因目的片段5.50 μL。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α中，收集后擴(kuò)培菌液，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒送至廣州市艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。當(dāng)雙酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功時(shí)，將重組表達(dá)載體命名為pET-32a-S10。

1. 7 融合蛋白表達(dá)

重組表達(dá)載體pET-32a-S10轉(zhuǎn)化至E. coil BL21（DE3），擴(kuò)大培養(yǎng)及誘導(dǎo)操作參照胡濤等（2015）的方法，待OD600=0.4時(shí)加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h，然后在冰上對(duì)菌體沉淀進(jìn)行超聲波破碎（Al-Juboori and Yusaf，2012；吳倩等，2015）：破碎4 s，停頓15 s，功率250 W，離心收集上清液和沉淀，以考馬斯亮蘭染色確定融合蛋白的表達(dá)形式。

1. 8 誘導(dǎo)條件優(yōu)化及目的蛋白純化

參考Cheng等（2016）、羅忠永等（2017）的方法進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)OD600=1.2、IPTG終濃度為1.6 mmol/L時(shí)，融合蛋白的表達(dá)量最高。誘導(dǎo)后進(jìn)行離心，超聲波破碎菌體沉淀，按試劑盒說(shuō)明通過(guò)Ni柱親和層析進(jìn)行純化，洗脫得到純化的融合蛋白。純化融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，參考Suwal等（2014）的方法用0.3 mol/L KCl溶液進(jìn)行回收。

1. 9 Western blotting分析

分別選取GCRV的基因I型（GZ1208和JX0901）、II型（HZ08和Hunan1307）、III型（104）毒株及KHV和ISKNV感染GCB細(xì)胞，感染7 d后收集GCB細(xì)胞，加入上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min，取5.00 μL進(jìn)行上樣；剩余步驟參考劉文慧等（2015）的方法，最后采用DAB顯色液進(jìn)行顯色。

1. 10 間接免疫熒光試驗(yàn)

將GCB細(xì)胞傳至96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至單層并占據(jù)孔板表面積80%～90%時(shí)，接種GZ1208、JX09-01、Hunan1307、HZ08和104株的病毒液，設(shè)立空白對(duì)照，接毒5 d后進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)（Gao et al.，2018；Wang et al.，2018），一抗為兔抗VP7多克隆抗體（1∶200倍稀釋），二抗為FITC標(biāo)記的羊抗兔IgM（1∶50倍稀釋），于倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2. 1 目的片段擴(kuò)增及序列測(cè)定結(jié)果

經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照無(wú)任何條帶，而S10基因擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性條帶位于750～1000 bp，大小約850 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與KU240083.1序列一致。

2. 2 VP7蛋白抗原表位分析結(jié)果

采用DNASTAR分析GZ1208株VP7蛋白氨基酸序列的抗原指數(shù)、親水性、表露性和疏松區(qū)域等參數(shù)，結(jié)果（圖2）顯示，位于第26～39位的氨基酸片段抗原指數(shù)、親水性和表露性均較高，可能為VP7蛋白的抗原表位。此外，BLAST比對(duì)分析結(jié)果顯示，VP7蛋白氨基酸序列在基因I型GCRV中高度保守。

2. 3 VP7合成肽抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

采用間接ELISA測(cè)定血清抗體效價(jià)，結(jié)果顯示抗體稀釋倍數(shù)為1∶256000時(shí)，多肽抗體與陰性對(duì)照比值為2.70，即VP7蛋白合成肽抗體效價(jià)約1∶256000。

2. 4 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

對(duì)重組質(zhì)粒pET-32a-S10進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約在6000和850 bp處各出現(xiàn)一條特異性條帶（圖3）；陽(yáng)性樣品送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果表明目的片段正確無(wú)誤。

2. 5 融合蛋白的表達(dá)與純化結(jié)果

通過(guò)SDS-PGAE分析，發(fā)現(xiàn)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)獲得的融合蛋白約在55 kD處出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其大小與預(yù)期結(jié)果（53 kD）基本一致；將IPTG誘導(dǎo)得到的菌體重懸液進(jìn)行超聲波破碎處理后，亦可得到與預(yù)期結(jié)果一致的特異性條帶（圖4），說(shuō)明VP7融合蛋白主要以包涵體的形式存在。

融合蛋白經(jīng)Ni柱親和層析純化后進(jìn)行電泳，發(fā)現(xiàn)純化后的融合蛋白約在55 kD處可見(jiàn)單一的特異條帶，而未純化的菌體總蛋白中含有較多的雜帶（圖5），說(shuō)明蛋白的純化效果良好。

2. 6 Western blotting分析結(jié)果

Western blotting分析結(jié)果（圖6）顯示，融合蛋白樣品約在55 kD處出現(xiàn)單一的特異性條帶，而空載體蛋白泳道無(wú)對(duì)應(yīng)條帶。此外，GZ1208株和JX09-01株樣品約在30 kD處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果基本一致；其他樣品則無(wú)任何條帶出現(xiàn)，說(shuō)明制備的合成肽抗體血清只能特異性識(shí)別VP7融合蛋白和基因I型GCRV。

2. 7 間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果

由圖7可知，制備的合成肽抗體可特異性識(shí)別感染基因I型GCRV的GCB細(xì)胞，感染細(xì)胞中出現(xiàn)特異性綠色熒光信號(hào)，而感染其他基因型GCRV及正常未感染病毒的GCB細(xì)胞中均無(wú)特異性綠色熒光出現(xiàn)。

3 討論

草魚(yú)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的主養(yǎng)品種，每年的產(chǎn)量超過(guò)500萬(wàn)t，位居淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之首（楊映等，2015），但也是水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物中病害最多發(fā)的一種魚(yú)類（Wu et al.，2017）。GCRV隸屬于水生呼腸孤病毒屬（Aquareovirus），是我國(guó)分離鑒定的第一株水生動(dòng)物病毒，其發(fā)現(xiàn)可追溯到1953年（Tian et al.，2017）；草魚(yú)感染發(fā)病的臨床癥狀主要是肌肉充血，腸道出血，鰭條、鰓蓋充血，故又稱為草魚(yú)出血病（Qiu et al.，2001）。GCRV基因組可分為11個(gè)節(jié)段雙鏈RNA，具有較高的變異性（Hao et al.，2017）。GCRV流行情況復(fù)雜，我國(guó)至少存在3種基因型（He et al.，2017），以基因II型為主，其次為基因I型，也有基因I型和II型混合感染的情況存在。GCRV的外衣殼蛋白主要是VP5和VP7，二者以200個(gè)三聚體的形式出現(xiàn)，而形成外層衣殼（Liu et al.，2017）。其中，VP7在GCRV感染宿主并使之患病的過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用（Ivanovic et al.，2007；Fang et al.，2008），尤其在病毒與宿主細(xì)胞相互作用及病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過(guò)程中，外衣殼上的三聚體作為受體識(shí)別位點(diǎn)存在（Yan et al.，2014），故推測(cè)VP7蛋白有助于GCRV入侵草魚(yú)（Shao et al.，2011）。

目前用于草魚(yú)出血病免疫防控的疫苗主要有滅活疫苗、弱毒疫苗和土法疫苗（高巖等，2017），也有部分實(shí)驗(yàn)室針對(duì)基因工程疫苗開(kāi)展了積極研究，如重組亞單位疫苗和核酸疫苗，主要采用GCRV的外衣殼蛋白制備。雖然市場(chǎng)上已有商品化的疫苗可供使用，但每年因草魚(yú)出血病暴發(fā)引起的經(jīng)濟(jì)損失仍居高不下。草魚(yú)出血病頻繁暴發(fā)可能與GCRV復(fù)雜的基因型有關(guān)。黃毅昌等（2016）研究指出，不同基因型毒株間多數(shù)功能性位點(diǎn)的保守性較低。Wang等（2016）研究證實(shí)，不同基因型GCRV在生物學(xué)特性上存在明顯差異，采用不同基因型GCRV免疫鮈鯽，其交叉保護(hù)性較低。本研究結(jié)果表明，以IPTG誘導(dǎo)獲得的VP7融合蛋白與鑰孔血藍(lán)蛋白載體蛋白偶聯(lián)后，免疫新西蘭白兔而獲得的VP7蛋白合成肽抗體只能識(shí)別基因I型GCRV，進(jìn)一步證實(shí)3種基因型GCRV的外衣殼蛋白存在明顯差異。

采用原核表達(dá)或真核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得重組蛋白，并免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制備多克隆抗體的方法較常見(jiàn)，但抗體效價(jià)水平不一。郝貴杰等（2010）利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備的GCRV VP7蛋白抗體效價(jià)僅1∶320；劉學(xué)光等（2013）通過(guò)原核表達(dá)傳染性造血器官壞死病病毒（IHNV）G蛋白并制備相應(yīng)的多克隆抗體效價(jià)為1∶105；黃新新等（2015）以原核表達(dá)桃拉綜合征病毒VP1高變區(qū)蛋白并制備多克隆抗體，其抗體效價(jià)為1∶217；黃謐和馮勇（2017）借助原核表達(dá)系統(tǒng)制備的大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白多克隆抗體的抗體效價(jià)為1∶50000；湯亞芳等（2018）利用原核表達(dá)蛋白制備的基因II型GCRV VP6蛋白抗體效價(jià)為1∶105。原核表達(dá)的融合蛋白在表達(dá)過(guò)程中常出現(xiàn)包涵體形式。包涵體不溶于水，無(wú)法形成正確次級(jí)鍵的表達(dá)產(chǎn)物，因此免疫后制備的血清有時(shí)不能正常識(shí)別原始生物蛋白。本研究中采用pET-32a（+）質(zhì)粒構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-32a-S10經(jīng)IPIG誘導(dǎo)表達(dá)后，融合蛋白也是以包涵體形式存在；制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體效價(jià)約1∶256000，其抗體效價(jià)高于一般的多克隆抗體，且抗體的特異性較好，能準(zhǔn)確識(shí)別基因I型GCRV，而不識(shí)別其他基因型毒株，表明制備獲得的合成肽抗體已達(dá)到預(yù)期設(shè)計(jì)要求，為后續(xù)的研究工作打下一定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

制備獲得的VP7蛋白合成肽抗體能特異性識(shí)別基因I型GCRV，而不識(shí)別其他基因型毒株，可用于草魚(yú)出血病的臨床診斷和基因I型GCRV的病原學(xué)研究。

參考文獻(xiàn)：

高華義，呂傳忠，任東興，陳文娟，辛波，梁姍，付旭彬. 2018. 多肽合成去勢(shì)疫苗免疫佐劑的篩選[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，（7）：169-172. [Gao H Y，Lü C Z，Ren D X，Chen W J，Xin B，Liang S，F(xiàn)u X B. 2018. The screening of immuno-adjuvant in peptide synthesis castration vaccine[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（7）：169-172.]

高巖，裴超，張超，李箏，孔祥會(huì). 2017. 草魚(yú)呼腸孤病毒疫苗的研發(fā)與應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，36（2）：237-242. [Gao Y，Pei C，Zhang C，Li Z，Kong X H. 2017. A review of research and development of vaccine against grass carp reovirus[J]. Fisheries Science，36（2）：237-242.]

郝貴杰，潘曉藝，姚嘉赟，徐洋，尹文林，沈錦玉. 2010. 草魚(yú)呼腸孤病毒衣殼蛋白VP7基因真核表達(dá)載體pCI-VP7的構(gòu)建及鑒定[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，34（5）：807-813. [Hao G J，Pan X Y，Yao J Y，Xu Y，Yin W L，Shen J Y. 2010. Construction and identification of recombinant eukaryotic expre-ssion vector pCI-VP7 containing GCRV VP7 gene[J]. Journal of Fisheries of China，34（5）：807-813.]

胡濤，安艷，呂群丹，徐英武. 2015. 擬南芥SPX1蛋白原核表達(dá)及純化分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，31（8）：88-93. [Hu T，An Y，Lü Q D，Xu Y W. 2015. Prokaryotic expression and purification of AtSPX1 protein in Arabidopsis thalia-na[J]. Biotechnology Bulletin，31（8）：88-93.]

黃劍波. 2016. PRRSV SC株GP5蛋白合成肽抗體的制備及ADE作用研究[D]. 成都：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Huang J B. 2016. Preparation of GP5 protein synthetic peptide antibody of PRRSV SC strain and the research of ADE[D]. Chengdu：Sichuan Agricultural University.]

黃謐，馮勇. 2017. 大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，56（21）：4146-4150. [Huang M，F(xiàn)eng Y. 2017. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the major capsid protein of Chinese giant salamander iridovirus[J]. Hubei A-gricultural Sciences，56（21）：4146-4150.]

黃新新，袁辰剛，寧雪，顧鳴，蔡強(qiáng)，劉銳，陸承平. 2015. 桃拉綜合征病毒VP1高變區(qū)蛋白抗體制備及初步特性分析[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志，（2）：221-224. [Huang X X，Yuan C G，Ning X，Gu M，Cai Q，Liu R，Lu C P. 2015. Polyclonal antibody specific for hypervariable region of VP1 capsid protein of Taura syndrome virus（TSV） prepartion and characteristic analysis[J]. Chinese Journal of Immunology，（2）：221-224.]

黃毅昌，雷燕，楊玉滔，閆秀英，簡(jiǎn)紀(jì)常，吳灶和. 2016. 草魚(yú)出血病分子流行病學(xué)及GCRV多樣性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（11）：120-125. [Huang Y C，Lei Y，Yang Y T，Yan X Y，Jian J C，Wu Z H. 2016. Molecular epidemiology of hemorrhage disease of grass carp and the diversity research of GCRV[J]. Journal of Anhui Agricultural Scien-ces，44（11）：120-125.]

李麗，鞠文，殷德輝，孟日增，李娟，宋秀英，徐坤. 2015. 生物素標(biāo)記的布魯菌多克隆抗體的制備[J]. 中國(guó)生物制品學(xué)雜志，28（2）：147-154. [Li L，Ju W，Yin D H，Meng R Z，Li J，Song X Y，Xu K. 2015. Preparation of biotin-labeled polyclonal antibody against Brucella abortus[J]. Chinese Journal of Biologicals，28（2）：147-154.]

劉文慧，闞麗麗，崔永勝，譚李倩，梁雪雪，李新，趙微. 2015. 人星狀病毒I型非結(jié)構(gòu)蛋白nsP1a及其C末端蛋白nsP1a/4的原核表達(dá)及鑒定[J]. 病毒學(xué)報(bào)，31（1）：46-50. [Liu W H，Kan L L，Cui Y S，Tan L Q，Liang X X，Li X，Zhao W. 2015. Prokaryotic expression and identification of human astrovirus nonstructural proteins，nsP1a and nsP1a/4[J]. Chinese Journal of Virology，31（1）：46-50.]

劉學(xué)光，鄭懷東，郭欣碩，羅靳，藺翠翠，王秋雨. 2013. 傳染性造血器官壞死病毒糖蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備[J]. 大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，28（3）：254-258. [Liu X G，Zheng H D，Guo X S，Luo J，Lin C C，Wang Q Y. 2013. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of glycoprotein gene in infectious hematopoietic necrosis virus[J]. Journal of Dalian Ocean University，28（3）：254-258.]

羅忠永，王印，楊澤曉. 2017. PRRSV M蛋白基因片段的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的初步建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，47（1）：95-99. [Luo Z Y，Wang Y，Yang Z X. 2017. Establishment of an indirect ELISA using the prokaryotically-expressed M protein for the detection of antibodies against PRRSV[J]. Chinese Veterinary Science，47（1）：95-99.]

湯亞芳，曾偉偉，王慶，王英英，石存斌，馮茹，高輝，王承寶. 2018. 草魚(yú)呼腸孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗體制備及其特異性分析[J]. 淡水漁業(yè)，48（1）：9-14. [Tang Y F，Zeng W W，Wang Q，Wang Y Y，Shi C B，F(xiàn)eng R，Gao H，Wang C B. 2018. Preparation and specification analysis of polyclonal antibody against grass carp reovirus type II VP6 protein[J]. Freshwater Fisheries，48（1）：9-14.]

王玉坤，李錦程，曹遠(yuǎn)銀. 2008. 兔抗滅多威多克隆抗體的制備[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，（2）：79-81. [Wang Y K，Li J C，Cao Y Y. 2008. Preparation of rabbit anti-methomyl polyclonal antibody[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，（2）：79-81.]

吳倩，張麗芬，陳復(fù)生. 2015. 超聲波對(duì)蛋白質(zhì)提取及改性影響的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械，31（4）：256-259. [Wu Q，Zhang L F，Chen F S. 2015. Research progress of ultrasonic effect on protein extraction and modification[J]. Food & Machinery， 31（4）：256-259.]

楊映，于輝，古勇明. 2015. 草魚(yú)呼腸孤病毒研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，42（15）：92-97. [Yang Y，Yu H，Gu Y M. 2015. Research progress on grass carp reovirus[J]. Guangdong Agricultural Sciences，42（15）：92-97.]

曾偉偉，王慶，王英英，李瑩瑩，郝貴杰，石存斌，沈錦玉. 2017. 草魚(yú)呼腸孤病毒HZ08株抗體IPMA檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，41（1）：142-149. [Zeng W W，Wang Q，Wang Y Y，Li Y Y，Hao G J，Shi C B，Shen J Y. 2017. Establishment and application of immunoperoxidase monolayer assay for detection of the antibody against grass carp reovirus HZ08[J]. Journal of Fisheries of China，41（1）：142-149.]

張敏利，盛佳璐，喻飛，王浩，呂立群. 2018. 草魚(yú)Fibulin-4蛋白與草魚(yú)呼腸孤病毒外衣殼蛋白相互作用的研究[J]. 病毒學(xué)報(bào)，34（4）：557-564. [Zhang M L，Sheng J L，Yu F，Wang H，Lü L Q. 2018. Studies on the interaction of grass carp Fibulin-4 protein with grass carp reovious outer capsid proteins[J]. Chinese Journal of Virology，34（4）：557-564.]

張玉瑤，馬秀麗，黃兵，李玉峰，于可響，李建亮，劉存霞，韓宏宇，崔言順. 2015. 鴨甲肝病毒1型和3型間接ELISA方法的建立與應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，55（4）：501-509. [Zhang Y Y，Ma X L，Huang B，Li Y F，Yu K X，Li J L，Liu C X，Han H Y，Cui Y S. 2015. Indirect ELISA for simultaneous detection of antibodies against duck hepatitis a type 1 and 3 viruses[J]. Acta Microbiologica Sinica，55（4）：501-509.]

宗乾坤，張也，呂立群. 2016. II型草魚(yú)呼腸孤病毒VP4、VP35蛋白多克隆抗體制備及其免疫原性分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，40（3）：355-362. [Zong Q K，Zhang Y，Lü L Q. 2016. Preparation and immunogenicity of polyclonal antibodies against VP4，VP35 protein of type Ⅱ grass carp reovirus[J]. Journal of Fisheries of China，40（3）：355-362.]

Al-Juboori R A，Yusaf T. 2012. Identifying the optimum process parameters for ultrasonic cellular disruption of E. coli[J]. International Journal of Chemical Reactor Enginee-ring，10（1）：1498-1502.

Andreolla A P，Erpen L M S，F(xiàn)randoloso R，Kreutz L C. 2018. Development of an indirect ELISA based on recombinant capsid protein to detect antibodies to bovine leukemia virus[J]. Brazilian Journal of Microbiology，pii： S1517-8382（18）30043-1. doi： 10.1016/j.bjm.2018.05.001.

Brudeseth B E，Wiulsr?d R，F(xiàn)redriksen B N，Lindmo K，L?kling K E，Bordevik M，Steine N，Klevan A，Gravningen K. 2013. Status and future perspectives of vaccines for industrialised fin-fish farming[J]. Fish & Shellfish Immunology，35（6）：1759-1768.

Chen C L，Sun X Y，Liao L J，Luo S X，Li Z Q，Zhang X H，Wang Y P，Guo Q L，F(xiàn)ang Q，Dai H. 2013. Antigenic analysis of grass carp reovirus using single-chain varia-ble fragment antibody against IgM from Ctenopharyngodon idella[J]. Science China. Life Sciences，56（1）：59-65.

Cheng Z Y，Zhang M，Ning R H，Hu B Q，Wen C G. 2016. Molecular cloning，prokaryotic expression and functional characterization of superoxide dismutase gene from Siniperca chuatsi[J]. Fish & Shellfish Immunology，53：116. doi： 10.1016/j.fsi.2016.04.097.

Dong Z D，Zhang J，Ji X S，Zhou F N，F(xiàn) Y，Chen W Y，Zeng Y Q，Li T M，Wang H. 2012. Molecular cloning， characterization and expression of cathepsin D from grass carp （Ctenopharyngodon idella）[J]. Fish Shellfish Immunology，33（5）：1207-1214.

Fan Y D，Rao S J，Zeng L B，Ma J，Zhou Y，Xu J，Zhang H. 2013. Identification and genomic characterization of a novel fish reovirus，Hubei grass carp disease reovirus， isolated in 2009 in China[J]. The Journal of General Virology，94（10）：2266-2277.

Fang Q，Seng E K，Ding Q Q，Zhang L L. 2008. Characterization of infectious particles of grass carp reovirus by treatment with proteases[J]. Archives of Virology，153（4）：675-682.

Gao S，Shi W，Wang Y T，Guo M T，Duan K X，Song A C，Lian G H，Ren T，Li Y J，Tang L J，Sun L，Liu M. 2018. Establishment and evaluation of an indirect immunofluorescence assay for the detection of salmonid alphavirus[J]. Letters in Applied Microbiology，66（4）：293-299.

Hao K，Chen X H，Qi X Z，Yu X B，Du E Q，Ling F，Zhu B，Wang G X. 2017. Protective immunity of grass carp induced by DNA vaccine encoding capsid protein gene （vp7）of grass carp reovirus using bacterial ghost as delivery vehicles[J]. Fish & Shellfish Immunology，64：414-425.

He L B，Zhang A D，Pei Y Y，Chu P F，Li Y M，Huang R，Liao L J，Zhu Z Y，Wang Y P. 2017. Differences in respon-ses of grass carp to different types of grass carp reovirus （GCRV） and the mechanism of hemorrhage revealed by transcriptome sequencing[J]. BMC Genomics，18（1）：452. doi： 10.1186/s12864-017-3824-1.

He Y X，Yang Q，Xu H X，Wu H，Wu F Y，Lu L Q. 2011. Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7 and its vaccine potential[J]. African Journal of Microbiology Research，5（13）：1643-1648.

Ivanovic T，Agosto M A，Chandran K，Nibert M L. 2007. A role for molecular chaperone Hsc70 in reovirus outer capsid disassembly[J]. Journal of Biological Chemistry，282（16）：12210-12219.

Liu B，Gong Y，Li Z，Hu X L，Cao G L，Xue R Y，Gong C L. 2016. Baculovirus-mediated GCRV vp7 and vp6 genes expression in silkworm and grass carp[J]. Molecular Biology Reports，43（6）：509-515.

Liu W S，Wang H，Yu F，Lu L Q. 2017. Grass carp reovirus outer capsid proteins VP5 and VP7 interact in vitro[J]. Archives of Virology，162（8）：2375-2380.

Lu L，Xu H，He Y，Li J. 2011. Protection of grass carp，Ctenopharyngon idellus（Valenciennes），through oral administration of a subunit vaccine against reovirus[J]. Journal of Fish Diseases，34（12）：939-942.

Luo S X，Yan L，Zhang X H，Yuan L，F(xiàn)ang Q，Zhang Y A，Dai H P. 2015. Yeast surface display of capsid protein VP7 of grass carp reovirus：Fundamental investigation for the development of vaccine against hemorrhagic di-sease[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，25（12）：2135-2145.

Mahajan S，Mohapatra J K，Pandey L K，Sharma G K，Pattnaik B. 2015. Indirect ELISA using recombinant nonstructural protein 3D to detect foot and mouth disease virus infection associated antibodies[J]. Biologicals，43（1）：47-54.

Qiu T，Lu R H，Zhang J，Zhu Z Y. 2001. Complete nucleotide sequence of the S10 genome segment of grass carp reovirus（GCRV）[J]. Diseases of Aquatic Organisms，44（1）：69-74.

Rao Y L，Su J G. 2015. Insights into the antiviral immu-nity against grass carp（Ctenopharyngodon idella） reovirus （GCRV） in grass carp[J]. Journal of Immunological Research，2015：670437. doi： 10.1155/2015/670437.

Shao L，Sun X Y，F(xiàn)ang Q. 2011. Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E. coli are capable of neutralizing viral infectivity[J]. Virology Journal，8：347. doi： 10.1186/1743-422X-8-347.

Suwal S，Roblet C，Amiot J，Doyen A，Beaulieu L，Legault J，Bazinet L. 2014. Recovery of valuable peptides from marine protein hydrolysate by electrodialysis with ultrafiltration membrane：Impact of ionic strength[J]. Food Research International，65：407-415.

Tanzadehpanah H，Asoodeh A，Mahaki H，Mostajabodave Z，Chamani J，Mojallal-Tabatabaei Z，Emtenani S，Emtenani S，Moradi M R. 2016. Bioactive and ACE binding pro-perties of three synthetic peptides assessed by various spectroscopy techniques[J]. Process Biochemistry，51（12）：2067-2075.

Tian Y Y，Jiao Z Z，Dong J J，Sun C F，Jiang X Y，Ye X. 2017. Grass carp reovirus-GD108 fiber protein is involved in cell attachment[J]. Virus Genes，53（4）：613-622.

Wang Q，Xie H L，Zeng W W，Wang L C，Liu C，Wu J X，Wang Y Y，Li Y Y，Bergmann S M. 2018. Development of indirect immunofluorescence assay for TCID50 measurement of grass carp reovirus genotype II without cytopathic effect onto cells[J]. Microbial Pathogenesis，114：68-74.

Wang Q，Zeng W W，Liu C，Zhang C，Wang Y Y，Shi C B，Wu S Q. 2012. Complete genome sequence of a reovirus isolated from grass carp，indicating different genotypes of GCRV in China[J]. Journal of Virology，86（22）：12466.

Wang Q，Zeng W W，Yin L，Wang Y Y，Liu C，Li Y Y，Zheng S C，Shi C B. 2016. Comparative study on physical-chemical and biological characteristics of grass carp reovirus from different genotypes[J]. Journal of The World Aquaculture Society，47（6）：862-872.

Wu M L，Li H Y，Jiang H，Hou G，He J，Jiang Y，Chen H. 2017. Structure and function of S9 segment of grass carp reovirus Anhui strain[J]. Virusdisease，28（1）：26-32.

Yan X Y，Wang Y，Xiong L F，Jian J C，Wu Z H. 2014. Phylogenetic analysis of newly isolated grass carp reovirus[J]. SpringerPlus，3：190. doi： 10.1186/2193-1801-3-190.

Ye X，Tian Y Y，Deng G C，Chi Y Y，Jiang X Y. 2012. Complete genomic sequence of a reovirus isolated from grass carp in China[J]. Virus Research，163（1）：275-283.

Yu F X，Du Y H，Huang X Y，Ma H，Xu B L，Adungo F，Hayasaka D，Buerano C C，Morita K. 2015. Application of recombinant severe fever with thrombocytopenia syndrome virus nucleocapsid protein for the detection of SFTSV-specific human IgG and IgM antibodies by indirect ELISA[J]. Virology Journal，12：117. doi： 10.1186/s12985-015-0350-0.

Zhang L L，Shen J Y，Lei C F，Li X M，F(xiàn)ang Q. 2008. The high level expression of grass carp reovirus VP7 protein in prokaryotic cells[J]. Virologica Sinica，23（1）：51-56.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）