基于系統(tǒng)藥理學分析三七總皂苷干預腦血管疾病的作用機制

聶娟　唐標

〔摘要〕 目的 采用系統(tǒng)藥理學方法，研究三七總皂苷（Panax notoginseng saponins， PNS）干預腦血管疾病的分子網(wǎng)絡(luò)機制。方法 首先通過文本挖掘系統(tǒng)挖掘PNS關(guān)聯(lián)的主要疾病，然后通過多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索PNS主要有效成分的作用靶點和腦血管疾病相關(guān)靶點；使用Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建有效成分-作用靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)、作用靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)以及疾病靶點蛋白-蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，并對兩個蛋白網(wǎng)絡(luò)進行交叉融合，篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，對核心網(wǎng)絡(luò)進行進一步分析和篩選。在此基礎(chǔ)上，利用Cytoscape的插件ClueGO對核心靶點進行生物過程和通路的富集分析，綜合結(jié)果和文獻檢索預測作用機制。結(jié)果 檢索得到6種主要有效成分的預測靶點194個以及腦血管疾病相關(guān)靶點353個，通過篩選得到PNS干預腦血管疾病的潛在靶點232個，核心靶點富集分析結(jié)果提示，PNS可能參與腦血管疾病中氧化應激、炎癥反應、凋亡以及血管新生的調(diào)控，并且通過調(diào)控FGFR信號通路、凋亡途徑、ERBB2信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子和VEGF信號通路、IL-10信號通路和炎癥小體信號通路，在腦血管疾病中發(fā)揮保護作用。結(jié)論 結(jié)果為進一步深入研究PNS干預腦血管疾病的藥理機制提供了重要依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 三七總皂苷；腦血管疾?。幌到y(tǒng)藥理學

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.015

〔Abstract〕 Objective To investigate the molecular network mechanism of Panax notoginseng saponins （PNS） in the intervention of cerebrovascular diseases based on systems pharmacology. Methods Firstly， text mining was used to identify the diseases associated with PNS， and then text mining and search of multiple databases were performed to obtain 194 putative targets of 6 major effective constituents and 353 targets associated with cerebrovascular diseases. The association between putative targets and cerebral ischemia was analyzed. Cytoscape 3.2.1 was used to construct effective constituent-putative target-pathway-disease network， putative target protein-protein interaction network， and disease target protein-protein interaction network， and the two protein networks were crossed and integrated to screen out core networks. The core networks were analyzed and screened. A total of 232 potential core targets involved in the intervention of cerebrovascular diseases by PNS were obtained. ClueGO， a plug-in of Cytoscape， was used for the enrichment analysis of biological processes and pathways for these core targets. Mechanism of action was predicted with reference to the above results and literature search. Results PNS might be involved in the regulation of oxidative stress， inflammatory response， apoptosis， and angiogenesis in cerebrovascular diseases. It exerted a protective effect against cerebrovascular diseases by regulating the FGFR signaling pathway， apoptosis pathway， ERBB2 signaling pathway， neurotrophin and VEGF signaling pathways， IL-10 signaling pathway， and inflammasome signaling pathway. Conclusion The results of this study provide an important basis for further research on the pharmacological mechanism of PNS in the treatment of cerebrovascular diseases.

〔Keywords〕 Panax notoginseng saponins； cerebrovascular disease； systems pharmacology

根據(jù)《柳葉刀》公布的2016全球疾病負擔研究報告數(shù)據(jù)，2016年總死亡人數(shù)為5 470萬，心腦血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）約占32%，居各類死因首位，其中缺血性心臟病和腦血管疾?。ㄗ渲校┱妓行哪X血管疾病死亡的85.1%，在中國，卒中和缺血性心臟病居死因前2位[1]，心腦血管疾病依舊是全球主要的疾病負擔。三七是五加科人參屬植物三七Panax notoginsen（Burk.） F.H.Chen的干燥根及根莖，是中醫(yī)治臨床治療心腦血管疾病的名貴中藥，在血液、心血管、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)等中都具有藥理活性。三七總皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）是三七的主要有效成分，含多種單體皂苷，其制劑如血栓通注射液和血塞通注射液等在心腦血管疾病的防治中廣泛應用。研究表明，PNS在心腦血管疾病中具有改善心肌缺血、抗血栓、抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抑制腦神經(jīng)細胞凋亡、改善腦缺血損傷等多方面的作用[2-3]。三七總皂苷中三七皂苷（notoginsenosides）R1， 人參皂苷（ginsenosides）Rg1， Rd， Re和 Rb1約占總皂苷含量的80%，這些成分是PNS在心腦血管疾病的主要藥效物質(zhì)[4-7]。另外有研究報道，人參皂苷Rg2能抗血栓和改善缺血，在心腦血管中發(fā)揮重要作用。已有的研究表明[4-7]，DNS的多種有效成分可以通過多靶點在心腦血管疾病中發(fā)揮保護作用，但是其作用機制還缺乏系統(tǒng)性的探討和分析，系統(tǒng)藥理學是從分子、細胞和網(wǎng)絡(luò)水平研究藥物與機體相互作用、規(guī)律和作用機制，近期廣泛應用于中藥作用機制的探討和研究，為中藥復雜作用的研究提供新的思路[8-9]。因此， 本研究采用系統(tǒng)藥理學的方法，分析PNS干預腦血管疾病的分子網(wǎng)絡(luò)機制，以期為臨床應用和后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

數(shù)據(jù)庫：Polysearch2文本挖掘系統(tǒng)（http：//wishart.biology.ualberta.ca/polysearch /index.htm），DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫（https：//cpi.bio-x.cn/drar/），Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/），Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca），Target-Prediction數(shù)據(jù)庫（http：//prediction.charite.de/index.php.site=chemdoodle_search_target）， DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）， DiGSeE文本挖掘數(shù)據(jù)（http：//210.107.182.61/geneSearch/），TD數(shù)據(jù)庫（http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/），Drugbank數(shù)據(jù)庫（https：//www.drugbank.ca/），OMIM數(shù)據(jù)庫（http：//www.omim.org/）和CTD數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org/）。軟件：Cytoscape軟件3.2.1版。

1.2 方法

1.2.1 PNS關(guān)聯(lián)疾病的分析 通過Polysearch2系統(tǒng)挖掘PNS關(guān)聯(lián)的疾病，Polysearch系統(tǒng)是一種基于網(wǎng)絡(luò)的文本挖掘工具，用于挖掘醫(yī)學文獻中的關(guān)鍵問題，可以查詢基因、蛋白組、藥物、疾病以及通路等之間的關(guān)聯(lián)綜合信息[10]。查詢的結(jié)果采用人工閱讀抽提語句校正，疾病名字根據(jù)醫(yī)學主題詞表（medical subject headings，MeSH，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/mesh/）進行匹配，校正名字，并按MeSH分類對疾病進行歸類。1.2.2 有效成分靶點的預測與分析 根據(jù)文獻報道[4-8]，選擇人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、Rg2和三七皂苷R1作為候選的有效成分，有效成分的靶點采用多數(shù)據(jù)聯(lián)合檢索和預測，通過Polysearch2系統(tǒng)文本挖掘藥物關(guān)聯(lián)的蛋白或基因，結(jié)果采用人工閱讀抽提語句校正；通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、Target-Prediction數(shù)據(jù)庫檢索、DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索有效成分靶點。DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫是以CPI為方法學的預測數(shù)據(jù)庫，它以小分子為研究對象，盡可能窮盡全部的上市藥物，得到一系列靶藥結(jié)合強度的矩陣并形成一個結(jié)合譜，用于尋找小分子和FDA所批準藥物間的相似性，進而挖掘“藥物-藥靶”關(guān)系，數(shù)據(jù)庫通過計算輸入化合物與數(shù)據(jù)庫蛋白的對接情況，來預測能夠與化合物相互作用的靶蛋白[11]。對預測到的靶點，按成分進行整理，剔除重復靶點，并導入Uniprot數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，剔除非人源靶點，并將所有靶基因名稱校正為其官方名稱（official

gene symbol）。建立預測靶點數(shù)據(jù)集，并將得到的預測靶點輸入DAVID（https：//david.ncifcrf.gov）數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，并將所有靶基因名稱校正為其官方名稱，設(shè)定閾值P<0.05進行GO（gene ontology）KEGG（kyoto cncyclopedia of genes and genomes）代謝通路富集初步分析，通過文本挖掘和文獻檢索通路與疾病的關(guān)聯(lián)性，分析預測靶點與疾病的潛在關(guān)聯(lián)性。

1.2.3 疾病相關(guān)靶點的收集和整理 通過DiGSeE文本挖掘數(shù)據(jù)、TTD數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫和CTD數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索疾病相關(guān)靶點，檢索方式采用疾病關(guān)鍵詞檢索，收集靶點，其中CTD數(shù)據(jù)庫收集有實驗驗證的靶點；DiGSeE文本挖掘數(shù)據(jù)可以挖掘疾病關(guān)聯(lián)的基因、磷酸化位點、甲基化和乙?；认嚓P(guān)信息，結(jié)果采用人工閱讀抽提語句校正[12]。整理靶點，剔除重復靶點和非人源靶點，并統(tǒng)一以官方基因名命名，建立疾病相關(guān)靶點數(shù)據(jù)集。

1.2.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 采用Cytoscape軟件根據(jù)有效成分、預測靶點、相關(guān)通路以及關(guān)聯(lián)疾病數(shù)據(jù)信息構(gòu)建有效成分-預測靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)[13]，并分析網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)拓撲學特征。利用Cytoscape的插件Bisogenet（Version 3.0.0），根據(jù)Bisogenet中的蛋白與蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病關(guān)聯(lián)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，在構(gòu)建中通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，數(shù)據(jù)設(shè)置中選擇蛋白與蛋白的相互作用，方法選擇輸入所有節(jié)點和所有的鄰近節(jié)點，輸出選擇基因[14]。應用Cytoscape的Merge工具對預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)進行交叉融合（Intersection），篩選出共有的網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的拓撲學特征通過Cytoscape的插件CytoNCA計算4個參數(shù)來評價，這4個參數(shù)分別為度中心性（degree centrality，DC）、中間中心性（betweenness centrality， BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）和鄰域連通度（neighborhood connectivity，NC），這4個參數(shù)是網(wǎng)絡(luò)藥理學研究中評價網(wǎng)絡(luò)節(jié)點的重要性的核心參數(shù)，值越大，說明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要[15]。綜合利用參數(shù)篩選核心網(wǎng)絡(luò)和核心靶點。

1.2.5 基因的生物學過程和通路富集分析 基因富集分析是分析基因表達信息的一種方法，富集是指將基因按照先驗知識，按照基因組注釋信息進行分類。采用Cytoscape的插件ClueGO對篩選出的核心靶點進行基因的生物學過程和代謝通路的富集分析，并進一步對機制網(wǎng)路進行可視化[16]，結(jié)合基因富集分析結(jié)果和文獻檢索預測主要有效成分在疾病中的可能機制。

2 結(jié)果

2.1 PNS關(guān)聯(lián)的主要疾病

通過polysearch2 系統(tǒng)文本挖掘藥物與疾病的關(guān)聯(lián)，結(jié)果如表1所示，13個疾病名字與PNS關(guān)聯(lián)，其中為Z score和R score系統(tǒng)查詢結(jié)果的評分，分數(shù)越高關(guān)聯(lián)關(guān)系越準確。將疾病名字與MeSH匹配歸類后，PNS關(guān)聯(lián)的疾病有心腦血管疾病（cardiovascular diseases）、腫瘤（neoplasms）、糖尿?。╠iabetes mellitus）和肝硬化（liver cirrhosis）。心腦血管疾病包括表中關(guān)聯(lián)的動脈粥樣硬化、腦梗死、腦缺血、腦卒中、冠心病，其中腦梗死、腦缺血和腦卒中在內(nèi)的腦血管疾?。╟erebrovascular disorders）是PNS關(guān)聯(lián)的最主要的疾病。

2.2 PNS主要有效成分靶點的預測和疾病相關(guān)靶點的收集

通過多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索三七總皂苷主要成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd、Rg2和三七皂苷R1的作用靶點，共得到194個預測靶點，其中人參皂苷Rg1 74個，人參皂苷Rb1 56個，人參皂苷Re 56個，人參皂苷Rd 70個，人參皂苷Rg2 59個，三七皂苷R1 55個，其中多種有效成分共有多個靶點。利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對預測靶點進行基因代謝通路的初步富集分析，結(jié)果表明，靶點主要參與代謝途徑、腫瘤相關(guān)通路、PI3K-Akt信號通路、Hepatitis B信號通路、HIF-1信號通路、Toll受體信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路以及神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路。通過文獻檢索和文本挖掘通路與疾病之間的關(guān)聯(lián)性，通路與4種疾病密切關(guān)聯(lián)，見圖1，其中代謝途徑、PI3K-Akt信號通路、HIF-1信號通路、Toll受體信號通路、MAPK信號通路、TNF信號通路以及神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路都與腦血管疾病密切相關(guān)，說明預測靶點與心腦血管疾病潛在關(guān)聯(lián)。通過文本挖掘和數(shù)據(jù)庫檢索的方式，以“cerebrovascular disorders”或“cerebrovascular diseases”為關(guān)鍵詞收集共到腦血管疾病相關(guān)靶點353個。

2.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

采用Cytoscape軟件構(gòu)建有效成分-預測靶點-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，如圖1所示，網(wǎng)絡(luò)圖產(chǎn)生232個節(jié)點，583條邊，每個節(jié)點平均與5個節(jié)點相連，圖中節(jié)點分別代表有效成分、預測靶點、通路以及疾病，邊分別代表活性成分-預測靶點之間的相互作用，預測靶點-通路之間的相互作用以及通路與疾病之間的相互作用，整個網(wǎng)絡(luò)中邊的短路徑53 592條（100%），說明網(wǎng)絡(luò)有良好的穩(wěn)定性。從圖1中可見一個活性成分可以作用于多個靶點，多個活性成分可以作用于同一個靶點，一條通路有多個預測靶點，一個靶點參與了多條通路，一條通路參與多種疾病以及一種疾病關(guān)聯(lián)多條通路，體現(xiàn)了有效成分多靶點多通路的協(xié)同作用特點。

根據(jù)系統(tǒng)生物學理論，蛋白與蛋白之間相互作用的網(wǎng)路是蛋白在疾病中發(fā)揮作用的關(guān)鍵，為了揭示靶點在藥物治療疾病中的作用，進一步采用Cytoscape的插件Bisogenet構(gòu)建預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，194個預測靶點生成的PPI網(wǎng)路含有5 824個節(jié)點，144 000條邊；353個腦血管疾病相關(guān)靶點生成的PPI網(wǎng)路含有7 731個節(jié)點，170 601條邊，其中節(jié)點代表蛋白，邊代表蛋白之間的作用。在此基礎(chǔ)上，采用Cytoscape的Merge工具對預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)進行交叉融合（Intersection），篩選共有網(wǎng)絡(luò)，即共有的蛋白相互作用網(wǎng)路，預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)與腦血管疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)共有的網(wǎng)絡(luò)含有4 007個節(jié)點，120 915條邊。共有網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的拓撲學特征通過Cytoscape的插件CytoNCA計算DC、BC、CC和NC參數(shù)來評價，并對網(wǎng)絡(luò)進行篩選，篩選核心網(wǎng)絡(luò)，也就是有效成分發(fā)揮作用的核心靶點。參照文獻報道的網(wǎng)絡(luò)篩選方法[17]，第一次采用DC值大于其兩倍中位數(shù)作為篩選指標，第二次采用DC、BC、CC和NC值大于其中位數(shù)作為篩選指標，其中得到PNS干預腦血管疾病的潛在核心靶點232個。見圖2。

2.4 PNS干預腦血管疾病的作用機制

采用ClueGO對PNS潛在干預腦血管疾病的232個靶點進行富集分析，結(jié)果見圖3，靶點參與了活性氧的代謝、對金屬離子的反應、平滑肌細胞的增值、凋亡調(diào)控、NO的生物合成、PI3K信號調(diào)控等生物過程，這些生物過程都與腦血管疾病密切關(guān)聯(lián)，主要調(diào)節(jié)腦血管疾病中的氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡、血管的損傷與修復等關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18-22]（圖3A）；而靶點主要參與FGFR信號通路、凋亡途徑、ERBB2信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子和VEGF信號通路、IL-10信號通路和炎癥小體信號通路（圖3B）。

3 討論

本研究采用系統(tǒng)藥理學方法對PNS干預腦血管疾病的多靶點、多通路機制進行研究。通過文本挖掘的方式揭示了在以往對PNS的研究中，PNS主要應用于心腦血管疾病的防治，并且通過多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合檢索PNS的6種主要藥效成分的靶點，靶點的初步分析表明預測靶點與腦血管疾病潛在關(guān)聯(lián)，并且表現(xiàn)出了多靶點、多通路的協(xié)同作用機制?；诘鞍着c蛋白之間的相互作用也就是蛋白網(wǎng)絡(luò)去探究靶點在疾病中的作用，通過預測靶點PPI網(wǎng)絡(luò)和疾病相關(guān)靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以及兩者的交叉融合，并根據(jù)網(wǎng)路拓補學特征篩選核心網(wǎng)絡(luò)，得到PNS潛在干預腦血管疾病的潛在核心靶點。通過核心靶點的生物過程和通路富集分析，結(jié)果提示，靶點參與的生物學過程和信號通路中，細胞凋亡是心腦血管疾病發(fā)生和演變的細胞學基礎(chǔ)；FGFR信號通路、ERBB2信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子和VEGF信號通路主要調(diào)節(jié)血管的新生；IL-10信號通路和炎癥小體信號通路主要調(diào)節(jié)腦血管疾病中的炎癥反應[23-26]。對結(jié)果的綜合分析和文獻檢索，預測PNA干預腦血管疾病的主要機制：PNS參與腦血管疾病中氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡以及血管新生的調(diào)控，并且通過調(diào)控FGFR信號通路、細胞凋亡途徑、ERBB2信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)因子和VEGF信號通路、IL-10信號通路以及炎癥小體信號通路在腦血管疾病中發(fā)揮保護作用。已有的研究[27-30]包括課題組的前期研究[31]，揭示了PNS在腦血管疾病中的保護作用，其機制包括多方面：促進血管新生；減少IL-1β的TNF-α分泌以及增加IL-10的分泌抑制腦缺血中的炎癥反應；抑制Caspase的活化抑制腦缺血中神經(jīng)元凋亡；以及調(diào)節(jié)VEGF的表達和抗氧化來減少腦缺血損傷。這些研究表明炎癥反應、凋亡、氧化應激以及血管新生是PNS干預心腦血管疾病的核心機制，這與預測結(jié)果吻合，為預測提供了實驗依據(jù)，但是目前還不明確PNS對這些生物過程的具體調(diào)控機制，還需要進一步研究。同時炎癥反應、凋亡、氧化應激以及血管新生也介導了腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程，是腦血管疾病干預的重要靶點，在腦血管疾病中存在多種相互作用，參與了腦血管疾病復雜的網(wǎng)絡(luò)病理機制。因此PNS對于心腦血管疾病中炎癥反應、凋亡、氧化應激以及血管新生具體的調(diào)節(jié)機制及其關(guān)聯(lián)分子網(wǎng)絡(luò)機制還需要進一步深入研究。

綜上所述，本研究基于系統(tǒng)藥理學研究PNS干預腦血管疾病的分子機制，預測了PNS干預腦血管疾病的潛在核心分子作用機制，并且揭示了PNS干預腦血管疾病多靶點-多途徑的作用特點，這為進一步深入研究PNS干預腦血管疾病作用機制及PNS的臨床應用提供了參考。

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（本文編輯 楊 瑛）