基于酪氨酸酶抑制活性的八白散組方研究

何微　王建芬　杜玉菲　劉鷹　馬迎

〔摘要〕 目的 優(yōu)化八白散中具有酪氨酸酶抑制活性的組方配伍，提高該組方的美白功效。方法 通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定八白散組方水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制率。以酪氨酸酶抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用均勻設(shè)計(jì)法探索八白散劑量比例與酪氨酸酶抑制率的關(guān)系。結(jié)果 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，八白散組方中m（白芷）∶m（白及）∶m（白附子）∶m（白茯苓）∶m（白牽牛）=42∶21∶2∶4∶51時(shí)，對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為86%，多元線性回歸分析表明白芷、白茯苓為酪氨酸酶抑制主要藥材，白牽牛和白附子在組方中對(duì)酪氨酸酶抑制活性存在負(fù)相關(guān)作用，隨著二者配伍比例增加，抑制活性呈下降的趨勢(shì)，而白及藥材未顯現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。結(jié)論 八白散組方配伍優(yōu)化后，對(duì)酪氨酸酶抑制活性與單味藥材相比存在差異，可為八白散組方配伍的進(jìn)一步研究提供參考。

〔關(guān)鍵詞〕 酪氨酸酶；均勻設(shè)計(jì)；八白散；紫外分光光度法

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R285.5 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.09.009

〔Abstract〕 Objective To optimize the prescription formulation and compatibility of Babai powder with tyrosinase inhibitory activity， and to improve the whitening effect of this prescription. Methods Ultraviolet spectrophotometry was used to measure the inhibition rate of tyrosinase by water extract of Babai powder. With the inhibition rate of tyrosinase as the assessment index， uniform design was used to investigate the correlation between the dosage ratio of Babai powder and tyrosinase inhibition rate. Results In the uniform design experiment， when m （Radix Angelicae Dahuricae）：m （Rhizoma Bletillae）：m （Rhizoma Typhonii）：m （white Poria cocos）： m （Pharbitis nil） was 42：21：2：4：51， the inhibition rate of tyrosinase activity was 86%. The multivariate linear regression analysis showed that Radix Angelicae Dahuricae and white Poria cocos were the main herbal medicines for tyrosinase inhibition. The ratios of Pharbitis nil and Rhizoma Typhonii were negatively correlated with tyrosinase inhibitory activity， and their inhibitory activity tended to decrease with the increase in their ratios. Rhizoma Bletillae had no significant inhibitory effect on tyrosinase. Conclusion There is a significant difference in tyrosinase inhibitory activity between the optimized prescription formulation and compatibility of Babai powder and each single medicine， which provides a reference for further research on the prescription formulation and compatibility of Babai powder.

〔Keywords〕 tyrosinase； uniform design； Babai powder； ultraviolet spectrophotometry

黑色素（melanin）主要由人體皮膚表皮基底層的黑色素細(xì)胞（melanocyte）產(chǎn)生，其在基底層的異常蓄積會(huì)造成色素沉著過(guò)度引起黃褐斑、雀斑、老年斑等，影響人們的生活質(zhì)量[1]。隨著對(duì)黑色素生物合成研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶是黑色素轉(zhuǎn)變過(guò)程中的主要限速酶，它的過(guò)量表達(dá)是導(dǎo)致色素沉著過(guò)度的主要原因，抑制酪氨酸酶的活性可以阻斷黑色素的生物合成反應(yīng)鏈，減少黑色素的生成，實(shí)現(xiàn)美白的效果[2-3]，同時(shí)氧自由基的存在加速了酪氨酸酶的催化過(guò)程，使黑色素不能及時(shí)代謝而沉積于表皮[4-6]。八白散最早出自明代的《必用全書(shū)》，作為宮中美白之品。隨著臨床對(duì)八白散應(yīng)用的新發(fā)展，新八白散除去被國(guó)家法規(guī)禁止使用的中草藥白丁香加入白芍，其組成為白僵蠶、白牽牛、白蒺藜、白及、白芷、白附子、白茯苓、白芍[7]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)八白散的各味藥材對(duì)酪氨酸酶的活化都有不同程度的抑制作用[8]。而組方配伍中提取物對(duì)酪氨酸酶抑制情況未見(jiàn)報(bào)道。本文運(yùn)用多巴速率氧化法[9]，在考察八白散組方中單味藥材水提物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用的基礎(chǔ)上，采用均勻設(shè)計(jì)法[10-12]探討新八白散劑量比例與酪氨酸酶抑制的關(guān)系。為進(jìn)一步優(yōu)化該組方的配伍提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試劑

白僵蠶（批號(hào)20140301）、白牽牛（批號(hào)20140204）、白蒺藜（批號(hào)20131209）、白及（批號(hào)20140509）、白芷（批號(hào)20131007）、白附子（批號(hào)20140401）、白茯苓（批號(hào)20131218）、白芍（批號(hào)20130911）購(gòu)自湖南省長(zhǎng)沙市楚仁堂大藥房，經(jīng)長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院生藥教研室龔邦老師鑒定為正品。酪氨酸酶標(biāo)準(zhǔn)品（上海寶曼生物科技有限公司，批號(hào)：R5428Y72）；L-多巴標(biāo)準(zhǔn)品（上海寶曼生物科技有限公司，批號(hào)：D1054）；無(wú)水乙醇、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等購(gòu)置國(guó)藥集團(tuán)，均為分析純。

1.2 儀器

AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；精密酸度計(jì)PHS-3C（上海雷磁儀器廠）；梅特勒AL204101電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；752型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；TDL-60B離心機(jī)（濟(jì)南賽暢科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 試劑的配置

2.1.1 磷酸鹽緩沖溶液的配制 分別稱(chēng)取干燥至恒重的無(wú)水磷酸氫二鈉3.55 g和磷酸二氫鉀3.40 g，調(diào)節(jié)pH值至6.8，加水溶解并稀釋至1 000 mL。

2.1.2 多巴溶液的配制 取多巴適量，加0.1 mol/L的鹽酸將其完全溶解，再用磷酸鹽緩沖溶液配制成1.5 g/L的多巴溶液，在4 ℃下避光保存，備用。

2.1.3 酪氨酸酶溶液的配制 精確稱(chēng)取160 kU/mg 的酪氨酸酶，用磷酸鹽緩沖溶液配成100 U/mg的酶液，-20 ℃下保存，使用前在4 ℃下解凍。

2.2 八白散組方供試品溶液的制備

將飲片粉碎（過(guò)60目篩）后，根據(jù)組方配伍劑量比，混合均勻后取樣約0.5 g，精密稱(chēng)定后，置于試管中，加入5 mL水，充分振搖后超聲處理30 min，過(guò)濾，水提液留存作為供試品溶液。

2.3 八白散水提液對(duì)酪氨酸酶抑制率的測(cè)定

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法[9]檢測(cè)，根據(jù)表1順序分別加入試劑并進(jìn)行反應(yīng)，在加入酪氨酸酶溶液后于37 ℃水浴中混合10 min后，分別加入1.5 g/L的L-多巴溶液0.8 mL，5 min后測(cè)定溶液在475 nm處吸光度值。按照以下公式計(jì)算八白散組方水提液對(duì)酪氨酸酶活性的抑制率為65.4%。

酪氨酸酶活性抑制率（%）=[（A1-A2）-（A3-A4）]×100%/（A1-A2）

2.4 八白散對(duì)酪氨酸酶抑制活性的劑量關(guān)系探討

2.4.1 八白散中單味藥材水提物對(duì)酪氨酸酶抑制率

分別取八白散中單味藥材，按照“2.2”項(xiàng)八白散組方供試品溶液的制備，以及“2.3”項(xiàng)酪氨酸酶抑制率測(cè)定方法，測(cè)定各單味藥材對(duì)酪氨酸酶的抑制率，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，八味藥材均有酪氨酸酶抑制作用，其中白芷、白茯苓、白及、白附子、白牽牛對(duì)酪氨酸酶抑制率均高于30%以上，為了進(jìn)一步探討該組方中各味藥材與酪氨酸酶的抑制關(guān)系，故選取上述五味藥材對(duì)酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行組方配比考察，進(jìn)而確定八白散中組方中酪氨酸酶抑制活性的較佳配方。

2.4.2 均勻設(shè)計(jì)表的選定 根據(jù)均勻設(shè)計(jì)法“水平數(shù)應(yīng)大于因素?cái)?shù)2倍”的原則以及一般數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)均要求樣本數(shù)要大于因素?cái)?shù)的3～4倍，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為5因素16水平，選用均勻設(shè)計(jì)表U16*（1612）每味藥以質(zhì)量為單位，設(shè)計(jì)16個(gè)水平研究八白散組方中酪氨酸酶抑制活性的劑量比例關(guān)系。為了避免量效關(guān)系對(duì)藥效的干擾，在保持各組分藥味比例不變的前提下，將各組劑量調(diào)節(jié)至相同（12.0 g），調(diào)整后各組分劑量見(jiàn)表3。

2.4.3 功效關(guān)系實(shí)驗(yàn)與評(píng)價(jià)結(jié)果 按表3中各組分劑量，以“2.2”中的操作步驟進(jìn)行八白散組方中活性成分提取，得到供試品原液。按照“2.3”所述進(jìn)行酪氨酸酶抑制率的實(shí)驗(yàn)。將16個(gè)水平（樣品），平行試驗(yàn)3次，每個(gè)水平的酪氨酸抑制率數(shù)據(jù)以平均值表示，結(jié)果見(jiàn)表3。直觀分析可知，第11組對(duì)酪氨酸酶抑制率最大，即m（白芷）∶m（白及）∶m（白附子）∶m（白茯苓）∶m（白牽牛）=42∶21∶2∶4∶51。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入SPSS Statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行多元線性回歸分析，得到酪氨酸酶抑制率回歸方程為：

Y=-20.159+18.667X1-9.743X2+16.965X3-7.8X4， P<0.05

方程有顯著意義，方差分析見(jiàn)表4。式中X1為白芷的質(zhì)量，X2為白附子，X3為白茯苓，X4為白牽牛。八白散組方中對(duì)酪氨酸酶主要起抑制作用的依次為白芷和白茯苓，而白牽牛和白附子在組方中對(duì)酪氨酸酶抑制活性存在負(fù)相關(guān)作用，隨著二者配伍比例增加，抑制活性呈下降的趨勢(shì)，而白及藥材未顯現(xiàn)出對(duì)酪氨酸酶有抑制作用。

3 討論

八白散組方中各單味藥材水提取液均有抑制酪氨酸酶作用。通過(guò)均勻設(shè)計(jì)法對(duì)酪氨酸抑制率高的五味藥材進(jìn)行組方配伍研究后，結(jié)果表明，白芷和白茯苓在組方中主要起抑制酪氨酸酶的作用，白及對(duì)酪氨酸酶抑制作用不明顯，白牽牛和白附子對(duì)酪氨酸酶抑制活性存在負(fù)相關(guān)作用。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)組方配伍研究具有不可替代的作用，在八白散組方后，對(duì)酪氨酸酶抑制活性與單味藥材相比存在差異。八白散組方研究中需要進(jìn)一步闡釋組方中其他藥材美白功效，為后續(xù)中藥美容化妝品的組方研究和開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

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（本文編輯 蘇 維）