艦船燃燒后有毒煙霧對大鼠肺組織損傷的長期影響

謝穎　陳雪　胡又　王瑩

【摘要】目的：明確艦船火災(zāi)中有毒煙霧吸入后是否對肺組織有長期的損傷，并探討其機制。方法：大鼠肺組織病理學(xué)HE染色檢查，氣管粘膜原代細胞培養(yǎng)及CK19免疫熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果：與對照組相比，煙霧吸入后3d可引發(fā)急性肺損傷，煙霧吸入后3m可引發(fā)慢性肺損傷，煙霧吸入后3m組細胞胞質(zhì)中CK19表達的綠色熒光明顯增強。結(jié)論：有毒煙霧吸入后可對大鼠肺組織造成長期慢性損傷，并有可能導(dǎo)致支氣管粘膜上皮細胞向惡性轉(zhuǎn)化。

【關(guān)鍵詞】煙霧吸入；肺損傷；CK19

Long term injury of lung tissue by smoke inhalation in rats after ship burning

Ying Xie， Xue Chen， You Hu， Ying Wang*

Huanghe North Avenue， Shenyang， Liaoning， Shenyang 110034， Liaoning， China

Abstract： Objective： This study was to determine whether long-term damage to lung tissue is caused by inhalation of toxic fumes in ship fires and to explore mechanisms. Methods： Histopathological examination of lung tissue in rats was performed by HE， primary tracheal mucosal cell culture and CK19 immunofluorescence staining， and confocal laser scanning microscopy. Results： Compared with the control group， acute lung injury was induced at 3 days after smoke inhalation， and chronic lung injury was induced at 3 m after smoke inhalation.The green fluorescence of CK19 expression in the cytoplasm of the 3m group after smoke inhalation was significantly increased. Conclusion： Toxic smoke can cause long-term chronic damage to lung tissue in rats， and may lead to malignant transformation of bronchial epithelial cells.

Key words： Smoke inhalation；Lung injury；CK19

[中圖分類號]R4 [文獻標識碼]A [文章編號]2096-5249（2018）04-026-03

前言

火災(zāi)是艦船海難中危險性及破壞性極大的事故。艦船艙室是相對密閉的空間，其中的非金屬材料在燃燒過程中會產(chǎn)生大量有毒的混合煙霧。已有研究表明，有毒煙霧可損害呼吸系統(tǒng)，造成急性肺損傷（acute lung injury；ALI），直接危害船員的生命安全[1-3]。但這些研究均局限于煙霧吸入后的急性肺損傷機制及治療方法[4]。如果未進行干預(yù)治療，有毒煙霧吸入后對肺組織是否有長期的損傷，目前未見文獻報道。本研究擬觀察艦船非金屬材料燃燒后的有毒煙霧后三個月，SD大鼠的肺組織的病理變化及氣管粘膜上皮細胞中細胞角蛋白19（CK19）的表達變化，明確有毒煙霧吸入后是否對肺組織有長期的損傷并探討其機制。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 共聚焦顯微鏡采用日本OLYMPUS公司FV500型顯微鏡。兔抗鼠CK19單克隆抗體和FITC標記的羊抗兔IgG均購自Sigma公司。

1.2 實驗動物與分組 SPF級雄性SD大鼠80只（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供），隨機分為3組（第1組：對照組40只；第2組：吸霧吸入后3d解剖組20只；第3組：吸霧吸入后3m解剖組20只。

1.3 吸入染毒 將燃燒材料按一定的用量比剪成10×10mm的小塊，置于燃燒箱內(nèi)，用液化氣爐點燃非金屬材料發(fā)煙3min后，將動物放入染毒箱內(nèi)吸入15min，然后將動物取出呼吸空氣。吸入染毒后3天解剖第一組中的20只動物及第2組全部動物，進行肺組織病理學(xué)檢查；其余第1組和第3組動物不給于任何干預(yù)性治療，將全部動物飼育3個月后，進行肺組織病理學(xué)檢查及氣管粘膜原代細胞培養(yǎng)。

1.4 解剖及肺組織病理學(xué)檢查 動物拉頸處死，無菌切取3～9環(huán)氣管，置于裝有30ml PBS的離心管中，用于氣管粘膜原代細胞培養(yǎng)。取出肺臟，10%中性福爾馬林灌注并固定，然后進行石蠟包埋HE染色，鏡檢。

1.5 氣管粘膜原代細胞培養(yǎng) 在超凈臺內(nèi)，用含青霉素（500U/ml）、鏈霉素（500?g/ml）和二性霉素B（5?g/ml）的D-Hanks液灌洗支氣管腔直至洗出液清亮為止，總沖洗時間不少于30min。最后往腔內(nèi)加滿37℃預(yù)溫的0.1%蛋白酶ⅪⅤ溶液（溶于含100U/ml青霉素和100?g/ml鏈霉素的D-Hanks液），夾閉氣管口后放入500ml的燒瓶，用D-Hanks液浸沒組織，再置于37℃恒溫搖床中約100r/min振搖消化40-60min。然后吸出消化液，用DMEM/F12（含100U/ml青霉素、100?g/ml鏈霉素和5?g/ml二性霉素B）洗液反復(fù)沖洗管腔，收集洗液，與消化液合并，1000r/min離心10min。離心前先取支氣管內(nèi)液體少許涂片在鏡下檢查細胞狀況。離心后棄上清液，沉淀用新鮮洗液重懸，再次離心5min。棄上清液，用完全培養(yǎng)液重懸沉淀，并反復(fù)吹打，然后以約105個/cm2密度接種于涂有鼠尾膠原的25cm2塑料培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)液為DMEM/F12，加胰島素（5?g/ml）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（10?g/ml）、氫化可的松（0.5?g/ml）、表皮生長因子（10ng/ml）、維甲酸（10-7mol/L）、牛血清白蛋白（0.5mg/ml）和5%胎牛血清，另加青霉素（100U/ml）和鏈霉素（100?g/ml）。一般24h后換液，用D-Hanks液蕩洗細胞2至3遍，換以新鮮的培養(yǎng)液，25cm2瓶每瓶3ml左右，繼續(xù)培養(yǎng)。隨后每2-3天換液一次。待細胞約80%左右匯合時進行傳代。用D-Hanks液蕩洗細胞2遍，加入1%胰蛋白酶/ 0.02% EDTA（1：1混合）約1.5ml，反復(fù)晃動8-10次，吸棄絕大部分消化液，將培養(yǎng)瓶置37℃培養(yǎng)箱中。待絕大部分細胞脫落，加入新鮮培養(yǎng)液輕輕吹打，吸取適量細胞懸液至新瓶，再補足培養(yǎng)液。

1.6 氣管粘膜原代細胞CK19免疫熒光染色 （1）細胞蓋玻片經(jīng)PBS洗滌后用0.1tritonX-100PBS液室溫孵育30min。

（2）用10g/L BSA封閉10min后，將即用型兔抗鼠CK19抗體分別加到載有細胞的蓋玻片上，4℃孵育過夜。

（3）經(jīng)PBS洗滌后加入FITC標記的抗兔IgG（稀釋度為1：200），37℃孵育60min。

（4）PBS洗滌，用無熒光緩沖甘油封固后，直接在CLSM下觀察并拍照。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.7 激光共聚焦顯微鏡觀察 以綠色熒光通道掃描觀察。綠色熒光的激發(fā)波長為488nm，在530nm波長以上觀察。用于圖像采集的顯微鏡物鏡為plan Neofluar 40×，數(shù)值孔徑（NA）為1.3，圖像存為512×512相素類型，掃描激發(fā)值選擇3%。每張玻片選擇細胞較為密集的區(qū)域，每高倍視野隨機選取20個細胞，利用軟件分析熒光強度。實驗重復(fù)進行3次，以平均熒光強度作為該蛋白的相對表達量。

1.8 數(shù)據(jù)記錄及統(tǒng)計分析 計數(shù)數(shù)據(jù)采用卡方檢驗。

2 結(jié)果

2.1 煙霧吸入后不同時相點大鼠肺組織病理學(xué)改變 煙霧吸入后3d解剖并進行病理組織學(xué)檢查，第2組20只動物肺組織病理改變均出現(xiàn)不同程度的肺泡上皮細胞壞死，肺泡腔內(nèi)大量含棕黃色顆粒的巨噬細胞聚集，還有少量紅細胞及水腫液，肺泡間隔增厚、水腫、毛細血管擴張充血，中性粒細胞浸潤，黑色顆粒物呈彌漫性沉積在小支氣管和肺泡腔內(nèi)（圖1B）。對照組動物肺組織未見異常（圖1A），第2組動物急性肺損傷的發(fā)生率高于對照組（P<0.01）。

煙霧吸入后3m解剖，第3組動物中的15只肺組織未見異常，其余5只動物可見肺泡間隔增厚，在增寬的肺泡間隔內(nèi)及小支氣管周圍可見梭形的成纖維細胞增生，肺間質(zhì)內(nèi)淋巴細胞的浸潤，可觀察到黑色顆粒物呈彌漫性沉積在小支氣管和肺泡腔內(nèi)，并可見異物巨細胞（圖1C，箭頭所示）。對照組動物肺組織未見異常，第3組動物慢性肺損傷的發(fā)生率高于對照組（P<0.05）。

2.2 原代培養(yǎng)細胞 培養(yǎng)24h后，低倍鏡下看到細胞呈多角形或圓形，以島嶼狀形式存在，單個細胞較少。已貼壁細胞形態(tài)更表現(xiàn)出典型的鵝卵石鋪路石狀排列（圖2）。

2.3 細胞形態(tài)學(xué)的改變 煙霧吸入后3m，原代細胞經(jīng)過CK19免疫熒光染色后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)學(xué)的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組20只動物的氣管粘膜原代細胞可以看到胞質(zhì)中有角蛋白表達（綠色熒光），呈彌漫性散在分布（圖3A）。第3組中有8只動物的氣管粘膜原代細胞胞質(zhì)中角蛋白表達增強，呈團塊狀分布（圖3B）。與對照組比較，第3組細胞胞質(zhì)中CK19表達的綠色熒光明顯增強（P<0.01）。

3 討論

艦船發(fā)生火災(zāi)后，非金屬材料燃燒時產(chǎn)生的煙霧是造成吸入性損傷的主要原因。ALI是ICU最常見的急危重癥，以肺泡上皮和肺毛細血管內(nèi)皮細胞的損傷為主要病理生理改變，以急性非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[5，6]。在本研究中，急性肺損傷病理改變特征為肺泡上皮細胞壞死，肺泡腔內(nèi)大量含棕黃色顆粒的巨噬細胞聚集，少量紅細胞及水腫液，肺泡間隔增厚，毛細血管擴張充血，中性粒細胞浸潤，黑色顆粒物呈彌漫性沉積在小支氣管和肺泡腔內(nèi)。說明煙霧作為損傷因素可直接作用于肺泡膜引起直接肺損傷，也可以通過激活中性粒細胞、巨噬細胞等引起間接的肺損傷。由于ALI病死率較高，目前常見的治療措施是機械通氣、藥物治療及適當采取細胞療法。但如果因某些原因未進行及時治療，有毒煙霧吸入后對肺組織是否有長期的損傷？本研究的結(jié)果是煙霧吸入后3m，第3組慢性肺損傷的發(fā)生率高于對照組?？梢姺闻蓍g隔增厚，成纖維細胞增生，淋巴細胞浸潤，可觀察到黑色顆粒物呈彌漫性沉積在小支氣管和肺泡腔內(nèi)，并可見異物巨細胞。說明隨著時間的延長，肺組織開始進行修復(fù)，且多數(shù)動物的肺損傷達到完全修復(fù)，但仍有少數(shù)動物的肺損傷由急性期轉(zhuǎn)入到慢性期。進一步的研究表明，經(jīng)過氣管粘膜原代細胞培養(yǎng)及CK免疫熒光染色后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組細胞胞質(zhì)中有CK19表達，呈彌漫性散在分布。與對照組比較，第3組細胞胞質(zhì)中CK19表達明顯增強。CK是上皮細胞的一種中間絲蛋白，是構(gòu)成細胞骨架、參與細胞運動等功能的一種蛋白質(zhì)，有很高程度的組織和分化特異性。CK至少由20余種多肽組成，其中CK19是一種分子量為40KD的角蛋白，近年來的研究表明，當氣管上皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化或癌變時，CK19的表達明顯增強，對非小細胞肺癌的診斷有一定意義，用于腫瘤的臨床輔助診斷、預(yù)后及療效評估[7，8]。

艦船火災(zāi)是海運業(yè)的職業(yè)危害因素之一。當密閉艙室內(nèi)發(fā)生火災(zāi)時，不完全燃燒的有毒煙霧可導(dǎo)致船員死亡或不同程度的肺損傷。本研究結(jié)果提示，艦船燃燒后有毒煙霧所致的ALI，需及時進行保護性肺通氣及藥物治療。如果受傷船員煙霧吸入后未能及時治療，隨著時間延長，肺損傷將由急性期轉(zhuǎn)為慢性期，而這種持續(xù)的慢性肺損傷及修復(fù)過程，有可能導(dǎo)致支氣管粘膜上皮細胞向惡性轉(zhuǎn)化。因此，應(yīng)對船員加強消防安全防護知識的宣傳教育，對船員進行有毒煙霧吸入危險性及預(yù)防措施教育，提高防護意識，是減少有毒煙霧吸入后肺損傷的有效措施。本研究評價了艦船火災(zāi)中有毒煙霧對肺組織的危害，可以為研究艦船火災(zāi)時船員對煙霧的防護措施及中毒船員救治技術(shù)提供試驗依據(jù)。

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基金項目： 本研究受2017年遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項目（20170025）及2017年度遼寧省教育評

價協(xié)會第二屆教學(xué)改革與教育質(zhì)量評價研究項目（PJHYYB17189）資助

*通訊作者簡介： 王瑩（1970.07-）， 女， 博士， 沈陽， 沈陽醫(yī)學(xué)院， 副教授，