單核細胞增生李斯特氏菌實時熒光RPA檢測方法的建立及應用

王金鳳，劉立兵，耿云云，石蕊寒，孫曉霞，南匯珠，姜彥芬，王建昌

（1.河北出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，河北石家莊 050000）（2.河北省檢驗檢疫科學技術研究院，河北石家莊 050051）（3.河北師范大學生命科學學院，河北石家莊 050024）

單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM），在2000年WHO食品安全工作計劃中，被列為重點檢測的食源性致病菌之一[1]。蔬菜、乳制品和肉類等食品都已被證實是單增李斯特菌的傳播載體[2]。近幾年食品污染物調(diào)查結果顯示，單增李斯特菌在生肉及即食食品中污染率較高[3]，我國散裝熟肉制品也具有引起單增李斯特菌病的風險[4]。LM可誘發(fā)食物中毒，導致李斯特菌病，主要引起人類腦膜腦炎和菌血癥[5,6]，發(fā)病率雖低，病死率高達12.8%～17%[7]。據(jù)估計，在歐洲每年可引起400人死亡[8]。在美國，李斯特菌病在食源性疾病引起的死亡中占第3位，每年約1600人感染李斯特菌病并有260人因此死亡[9]。因此，單增李斯特菌對人類健康的危害使得對食品中該菌的檢測具有重要意義。

目前對食品中LM的檢測方法主要是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和分子生物學方法。我國目前對LM傳統(tǒng)培養(yǎng)方法多采用 GB 4789.30-2016[10]，該方法至少需要 4～5 d（若為陽性，則需要7 d）完成對樣品中LM的檢測，操作繁瑣復雜，并且對檢測人員技術要求較高。目前分子生物學技術在食源性致病菌的檢測中已經(jīng)得到了廣泛應用[11]。劉萬靜等[12]應用LMReal-time PCR 方法成功的從134例風險監(jiān)測樣本中檢測出8例LM陽性；黃朱梁等[13]建立了實時濁度 LAMP方法檢測食品中LM，并從160份不同種類的食品中檢出5份陽性樣本。Real-time PCR方法需要60 min左右，且均需要昂貴的儀器設備，專業(yè)的技術人員，以及良好的實驗室環(huán)境；實時濁度LAMP方法反應時間也為60 min，無法實現(xiàn)對LM的快速檢測。上述方法對于口岸現(xiàn)場及食品突發(fā)事件中對LM的現(xiàn)場快速檢測，具有一定的局限性。

重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA）是一種新的核酸等溫擴增技術，是一種依賴結合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶三種核心酶，對核酸進行特異、靈敏、等溫、快速擴增，對試驗設備、人員和資源的要求較低。目前RPA技術已廣泛應用于轉基因大豆[14]，病毒[15,16]、細菌[17,18]和寄生蟲[19]等多種病原的快速檢測，但未見RPA方法用于LM檢測的報道。

鑒于此，本研究基于LM特異性基因hlyA的保守區(qū)域，設計特異性RPA引物和exo探針，建立了快速檢測LM的實時熒光RPA方法，并進行該方法的特異性、靈敏性、人工污染樣品驗證試驗，為實現(xiàn)LM的現(xiàn)場快速檢測提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

本實驗所用菌株見表1。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains in this study

注：+，陽性結果；-，陰性結果。

1.1.2 主要試劑

TwistAmpTMexo kit，購自英國TwistDx公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；LB增菌液，單核細胞增生李斯特氏菌選擇性平板，均購自北京陸橋技術股份有限公司；Premix Ex Taq，購自 TAKARA 公司。

1.1.3 主要設備

NanoDrop 2000c核酸蛋白分析儀，美國Thermo公司；ABI 7500實時熒光定量PCR儀，美國ABI公司；GenieⅢ等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)，英國OptiGeneLimited公司。

1.2 方法

1.2.1 探針和引物設計

參考Genbank中LMhlyA基因序列（HM58959），根據(jù)保守區(qū)域設計合成特異性的 real-time RPA和real-time PCR引物探針，擴增片段分別為158 bp和95 bp。

所有引物和探針均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（見表2）。

表2 引物和探針序列Table 2 Primer and probe sequences

1.2.2LMreal-time RPA 反應體系和條件

使用 TwistAmpexokit配制 50 μL RPA 反應體系，其中包括LM-RPA-F/R（10 μM）各 2.1 μL，LM-RPA-P（10 μM）0.6 μL，Rehydration Buffer 29.5 μL，ddH2O 12.2 μL，模板 1 μL，280 mM MgAc 2.5 μL。實驗操作為：將除去模板和MgAc的所有試劑預混后轉入含有凍干酶制劑的0.2 mL反應管中，充分混勻；取1 μL模板加入反應管中；取2.5 μL MgAc加在反應管蓋中，蓋緊后瞬時離心并渦旋；置于等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)中，設置反應條件 37 ℃ 20 min。

1.2.3LMreal-time PCR 反應體系和條件

根據(jù)本實驗室已優(yōu)化好的反應條件，配制25 μL real-time PCR反應體系，包括Premix Ex Taq（包含PCR buffer、DNA聚合酶和dNTPs等），LM-PCR-F/R（10 μM）各 1.5 μL，LM-PCR-P（5 μM）0.8 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 7.7 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s（收集熒光），35 個循環(huán)。

1.2.4LMreal-time RPA 特異性和靈敏性試驗

提取表1中LM和其它菌株DNA，進行RPA方法特異性驗證試驗。將LM過夜純培養(yǎng)，取1 mL菌液使用細菌基因組提取試劑盒提取 DNA，并測定DNA濃度。使用滅菌水進行10倍梯度稀釋，使其濃度在 5.0×104～5.0×10-3pg/μL 范圍，分別取 1 μL 各稀釋濃度DNA作為模板進行RPA方法靈敏性試驗，確定該方法的最低檢測限。同時與real-time PCR方法進行靈敏性比較。

1.2.5LMreal-time RPA 重復性實驗

將LM純培養(yǎng)物按10倍梯度稀釋，隨機取3個稀釋度的樣本分別作5個重復，用real-time RPA方法進行批內(nèi)和批間的擴增檢測，同時計算 Ct值的變異系數(shù)，評價實驗結果的重復性。

1.2.6 人工污染樣品的檢測

將LM經(jīng)過夜純培養(yǎng)后，用生理鹽水進行10倍列稀釋，選取10-6、10-7稀釋度菌液作平板計數(shù)，計算純培養(yǎng)物的初濃度。經(jīng)稀釋后，選取0～5、20～30、50～100 CFU范圍內(nèi)的菌量分別添加到25 g羊肉、生菜樣品（預先已經(jīng)GB 4789.30-2016檢測為LM陰性，并經(jīng)GB 4789.2-2016和GB 4789.3-2016檢測樣品中細菌總數(shù)和大腸菌群）中，再添加225 mL的LB增菌液，同時做空白對照，30 ℃培養(yǎng)。選取1 mL前增菌時間分別為14 h和20 h的培養(yǎng)液，使用試劑盒進行LM基因組DNA提取，加50 μL ddH2O進行溶解，并取1 μL進行real-time RPA檢測。同時與real-time PCR、GB 4789.30-2016方法進行平行驗證，比較三種方法的檢測結果。同時使用GB 4789.30-2016方法測定人工污染樣品經(jīng)不同時間前增菌后的LM數(shù)量。

2 結果與討論

2.1LMreal-time RPA 方法的特異性結果

圖1 LM real-time RPA特異性結果Fig.1 Specific results of real-time RPA for LM

應用所建立的LMreal-time RPA方法對表1中標準菌株和分離菌的基因組DNA進行特異性擴增，結果在20 min內(nèi)，僅有LM出現(xiàn)特征性熒光擴增曲線，其余菌株均無擴增曲線。具體結果見表1。圖1為部分菌株特異性檢測結果。上述結果說明本方法具有良好的特異性。

2.2LMreal-time RPA 方法的靈敏性結果

經(jīng)NanoDrop 2000c核酸蛋白分析儀測定，所提取的細菌基因組 DNA 濃度為 5×104pg/μL。經(jīng) 10 倍列梯度稀釋至濃度 5×10-3pg/μL，以此作為模板進行LMreal-time RPA和real-time PCR靈敏性檢測，結果如圖 2所示。當 DNA 濃度為 5×104～5×10-1pg時，real-time RPA均出現(xiàn)明顯的擴增曲線，且 TT值在2:30～7:12 之間，說明所建立方法的檢出限為 5×10-1pg（圖2a）。同real-time PCR結果相比，兩種方法的靈敏性一致，均可檢測到5×10-1pg（圖2b）。就檢測時間而言，real-time RPA僅需要2:30～7:12就可實現(xiàn)對5×104～5×10-1pg 基因組DNA 的檢測，而real-time PCR則需要約 25～55 min（Ct值在 15.32～31.70 之間）。具體結果見表3。

圖2 LM real-time RPA和real-time PCR靈敏性結果Fig.2 Sensitivity of real-time RPA and real-time PCR for LM

表3 LMreal-time RPA與real-time PCR方法靈敏性結果比較Table 3 Comparison of sensitivity results of real-time RPA and realtime-PCR for LM

2.3LMreal-time RPA 方法的重復性結果

重復性實驗結果表明，無論批內(nèi)和批間重復實驗Ct值的標準差均小于1，變異系數(shù)＜5%（見表4），說明所建立的方法具有良好的重復性。

表4 LM real-time RPA重復性實驗Table 4 Repeatability test of LM real-time RPA

2.4 人工污染樣品檢測結果

通過計算原始菌液量，最終添加至羊肉和生菜樣品中的初始菌量分別為 3、29、62 CFU/25 g。取 14、20 h的增菌液進行LM基因組DNA提取，應用本研究建立的real-time RPA方法進行檢測。結果表明，空白對照無任何擴增曲線，未檢測到LM，說明實驗成立。對于接菌量為3 CFU/25 g羊肉和生菜樣品，增菌14 h 后，real-time RPA 方法可在 12 min 內(nèi)實現(xiàn)對LM的檢測。對于相同樣品，real-time PCR與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法均檢測到LM。三種方法檢測結果均一致，但是real-time RPA能夠在12 min內(nèi)獲得所有陽性結果，real-time PCR 需要 55 min，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法則需要 7 d（結果見表5）。

表5 人工污染樣品檢測結果Table 5 Results of artificially contaminated samples

3 結論

3.1 同其它核酸擴增技術相比，RPA技術具有以下突出的優(yōu)勢：操作簡便、反應時間短、特異性強、靈敏性高、假陽性率低、對核酸要求質量不高等。但由于RPA反應原理和反應過程的特殊性，所用引物探針的長度和標記方法與以往分子生物學方法標記不同，在設計程序上要嚴格按照其規(guī)則進行，尤其注意發(fā)卡結構和非特異性擴增的發(fā)生，這也是決定其擴增成敗的關鍵。只有完全掌握了RPA引物和探針的設計原則，才能綜合試驗結果篩選出最佳的引物和探針。

3.2 本研究選取LM特異性基因hlyA為靶基因，設計RPA引物和exo探針，建立了LMreal-time RPA方法。該方法僅對LM出現(xiàn)特異性熒光擴增曲線，具有很好的特異性；檢出限可以達到5×10-1pgLM基因組DNA，與本實驗室建立的LMreal-time PCR方法一致，但是 real-time RPA 所需要的反應時間遠遠少于real-time PCR方法。顧思宇等[20]建立的LAMP方法對LM純培養(yǎng)物的檢測限為2.27 fg/μL，低于本研究建立的real-time RPA方法，但LAMP反應時間為45 min，明顯高于本研究建立的RPA方法。同時real-time RPA方法重復性良好，無論批內(nèi)還是批間其變異系數(shù)均小于5%。

3.3 本研究中所選用生菜樣品菌落總數(shù)和大腸菌群背景值低，而羊肉樣品背景值較高，但是兩種樣品在人工污染相同濃度的LM時，均可以通過real-time RPA實現(xiàn)有效檢測，說明所建立的real-time RPA方法受樣品基質和背景值影響較小。樣品增菌14 h后，在接菌量為 3 CFU/25 g 時，real-time RPA 方法能夠在 12 min內(nèi)實現(xiàn)對LM的檢測；在接菌量為62 CFU/25 g時，real-time RPA僅需要6～7 min即可實現(xiàn)對LM的有效檢測。對不同濃度和不同增菌時間的人工污染樣品，real-time RPA 檢 測結果同 realtime-PCR、GB 4789.30-2016一致，但是檢測時間大大縮短，有效節(jié)約了人力物力成本，能夠實現(xiàn)對LM的快速檢測。

3.4 本研究建立的LMreal-time RPA 檢測方法，能夠在37 ℃，20 min內(nèi)實現(xiàn)對食品中LM的快速分子檢測，真正實現(xiàn)了快速、簡便、靈敏和特異等特點，并且不需要復雜的儀器設備，可應用于食品突發(fā)事件中LM的現(xiàn)場快速檢測，對保障我國食品安全具有重要意義。在后續(xù)工作中，本研究將繼續(xù)完善大量臨床樣本的LMreal-time RPA檢測和方法驗證，以期形成相應的國家標準。同時探索食源性致病菌的多重 real-time RPA方法和基于測流層析試紙條檢測的RPA方法將是下一步的研究重點。