添加不同水平NaCI對蛋黃漿質凝膠性的影響研究

楊海燕，金永國，孫秀秀，靳國鋒，馬美湖

（華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖北武漢 430070）

咸蛋是我國乃至東南亞地區(qū)的一種傳統(tǒng)腌制蛋制品，因其獨特的口感和風味受到廣大消費者的喜愛，是人們?nèi)粘ｏ嬍持械囊环N重要食品。在咸蛋中蛋黃是消費者最喜愛食用的部分，也是咸蛋品質好壞的重要評價部位。一般好的咸蛋要求蛋黃“鮮、細、嫩、松、沙、油”。目前，由于市場的廣泛需求，蛋黃會被直接 腌制成咸蛋黃，大量用于蛋黃包、粽子、月餅等中式食品中[1,2]。

蛋黃是一種O/W的乳狀液，溶解相為漿質，其余的則為懸浮的顆粒，適度離心得到漿質和顆粒成分[3,4]；漿質占蛋黃干物質的77%～81%，其中包括85%的低密度脂蛋白和15%的卵黃球蛋白[5]；而在咸蛋及咸蛋黃腌制過程中，在 NaCl的作用下，蛋黃內(nèi)原本分布均勻的乳化型細小脂肪珠分離析出，水分向外擴散，親油基團相互聚合，蛋黃中穩(wěn)定的乳狀液體系被破壞，最終形成的咸蛋黃豐潤鮮紅、油露松沙、營養(yǎng)豐富[6,7]。目前多數(shù)研究集中于腌制方法和工藝研究，而對于腌制過程中單就蛋黃漿質及其凝膠特性的研究較少[8,9]；例如，關于蛋黃漿質Anton等[3]人的研究中發(fā)現(xiàn)蛋黃漿質乳化性高于顆粒；Sirvente等[11]人研究發(fā)現(xiàn)高壓顯著影響漿質乳化性，但并不改變漿質流變特性[10]；孫嘉文等研究了冷凍對蛋黃全蛋液、蛋黃顆粒和蛋黃漿質三部分乳化性質的影響，發(fā)現(xiàn)蛋黃進行冷凍時，蛋黃顆粒和蛋黃漿質之間可能發(fā)生了相互作用，產(chǎn)生分子間和分子內(nèi)的聚集行為，導致蛋黃經(jīng)過冷凍后乳化容量以及可溶性蛋白等顯著降低；Laca等[12]對蛋黃漿質及顆粒性質的研究中發(fā)現(xiàn)，蛋黃顆粒比漿質抵抗熱變性的能力強，這是因為漿質中的低密度脂蛋白對熱敏感；漿質中的蛋白在蛋黃凝膠中起著重要作用，其凝膠性是禽蛋蛋白較重要的功能特性，研究蛋黃漿質在腌制過程中的凝膠性具有重要意義。本實驗旨在研究不同 NaCl濃度下蛋黃漿質凝膠性的影響，觀察不同濃度NaCl腌制蛋黃24 h后，蛋黃凝膠保水性、凝膠質構；漿質流變性、粒徑分布等，以探討腌制蛋黃漿質凝膠變化情況，為咸蛋腌制過程中漿質凝膠變化提供理論基礎，并為未來蛋品開發(fā)提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋（海蘭褐殼蛋），購自華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場。

NaCl、正己烷均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Sigma 3-30N型高速冷凍離心機，美國Sigma公司；JSM-6390型掃描電子顯微鏡，日本 NTC；TA.XT.plus型質構儀，英國 stable micro system；ULtrascan VIS臺式分光測色儀，美國Hunter Lab公司；DHR2型流變儀，美國沃特斯公司；APA2000型激光粒度分布儀，英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

新鮮雞蛋去殼分離蛋清、蛋黃，獲得去除蛋黃膜的蛋黃液。采用直接腌制的方法加入NaCl，其中NaCl（NaCl占蛋黃液質量百分比）添加量分別為0%（設為對照組）、0.5%、1.0%、1.5%、2%（咸蛋腌制成熟后，蛋黃含鹽量一般為1.5%左右，設為腌制組），在4 ℃條件下腌制24 h；腌制完成后加入1.5倍的蒸餾水，攪拌均勻調節(jié)pH=7于4 ℃放置過夜，10000 r/min離心 40 min 獲得蛋黃漿質，置于 4 ℃下保存，備用[13]。

1.3.2 漿質凝膠的制備

取15 mL漿質于20 mL塑料杯中，用保鮮膜封口，用橡皮筋扎緊后90 ℃水浴加熱40 min，然后取出用自來水冷卻20 min，放于4 ℃條件下冷藏過夜。

1.3.3 漿質凝膠保水性的測定

凝膠保水性的測定[12]：將制備好的凝膠置于高速冷凍離心機中，10000 r/min離心10 min后，稱總重，去除離心出的水分，再次稱重，按照以下公式計算凝膠保水性（water holding capacity，WHC）：

其中W1為離心管和離心除水后的凝膠重，W2為離心前離心管和凝膠重，W為離心管重。每個處理有3個平行。

1.3.4 漿質凝膠質構測定

用質構儀測量蛋黃漿質凝膠質構特性[14]。將樣品切成1 cm×1 cm×1 cm 的正方體，并將其中心置于質構儀探頭的正下方樣品臺上，采用P/36R探頭對樣品進行兩次壓縮。測定條件如下：測前速度2.0 mm/s；測試速度1.0 mm/s；測后速度2.0 mm/s；壓縮百分比50%，觸發(fā)力1.0 g，觸發(fā)類型auto數(shù)據(jù)攝取速率200 pps停留時間5 s。測試完成后，用儀器自帶軟件內(nèi)部宏對測試結果進行處理，為了保證測定結果的準確性，質構測定重復10次。得到凝膠硬度（Hardness）、彈性（Springiness）、凝聚性（Cohesiveness）、咀嚼性（Chewiness）等。

1.3.5 漿質成分粒徑分布測定

采用MS2000型激光粒度分析儀測定蛋黃漿質中粒度的分布情況。光學參數(shù)：相對折射率1.44，粒子吸收0，連續(xù)相折射率為1.33。

1.3.6 漿質成分色度測定

采用Ultra Scan VIS型色度儀測定蛋黃漿質的明度（L*）、紅綠值（a*）、黃藍值（b*）。L*值 0～100表示全黑至全白，a*值由小至大表示綠色至紅色，b*由小至大表示表示藍色至黃色。

1.3.7 漿質蛋白SDS-PAGE電泳測定

將樣品1:1加入正己烷磁力攪拌30 min，于4 ℃環(huán)境中靜置4 h后離心除去有機試劑，除去漿質中脂質成分；配置蛋白濃度為2 mg/mL的溶液，取40 μL樣品，加10 μL蛋白上樣緩沖液，混合均勻后沸水浴煮沸5 min，取20 μL上樣。采用濃縮膠5%，分離膠12%進行電泳分析。

1.3.8 漿質成分流變特性測定

采用馬爾文旋轉流變儀，在25 ℃下，選擇0°/40 mm平板系統(tǒng)，1 mm平板間距，固定振蕩應力為10%，測定漿質的彈性模量(G')、黏性模量(G")隨振蕩頻率的變化，振蕩頻率的變化范圍為0.1～40 Hz。

1.3.9 掃描電子顯微鏡觀察漿質凝膠結構

漿質凝膠切成1 cm×1 cm×1 cm體積大小塊狀，50 ℃烘干30 min脫去水分，于中心取樣裝裱于掃描電鏡板上，噴金處理后用掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用WPS office 2016進行統(tǒng)計處理，采用 IBM SPSS Statistics 22對數(shù)據(jù)進行方差分析，用Origin Pro 8.5 軟件作圖，以p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 NaCl處理對蛋黃漿質凝膠保水性的影響

圖1 不同NaCI濃度下蛋黃漿質凝膠保水性影響 Fig.1 Effect of different concentration of NaCl treatment on water holding capacity of egg yolk plasma gel

由圖1可知，蛋黃漿質凝膠在NaCl添加量為2%時，蛋黃漿質凝膠保水性最好，且與其他處理組凝膠保水性差異顯著（p＜0.05），蛋黃漿質凝膠保水性隨NaCl濃度的增加而增大。

LI J等[15]研究發(fā)現(xiàn)蛋黃凝膠在加入1.8% NaCl后，凝膠保水性從98.70%逐漸增加到99.16%，和本文研究結論一致。這可能是因為 NaCl的加入增加了凝膠內(nèi)部水的流動性與分布，并使蛋白分子易于形成水離子鍵，改變凝膠內(nèi)部疏水相互作用。凝膠的保水性反映了蛋黃漿質對水的保持能力，保水性越高，更好防止水分子的逸出[16]。

2.2 NaCl處理對蛋黃漿質凝膠質構特性影響

由表 1可知，用 0.5%、1%、1.5%、2%濃度的NaCl腌制24 h后，蛋黃漿質凝膠的硬度值均低于對照組，特別是2%濃度的NaCl處理后，蛋黃漿質凝膠硬度比0%對照組顯著降低了10.719 N（p＜0.05）；漿質凝膠內(nèi)聚性隨NaCl濃度增加，呈現(xiàn)下降趨勢，0.5%、1%及1.5%NaCl組間變化無差異，而2%濃度NaCl處理組差異顯著（p＜0.05）；蛋黃漿質凝膠彈性隨 NaCl添加量的增大基本不變；腌制組樣品的咀嚼性和膠黏性均低于0% NaCl組，但是隨著NaCl添加量的增加，未呈現(xiàn)直線下降趨勢；綜上，2%NaCl添加量時，漿質凝膠質構特性最差，凝膠品質降低。

蛋黃漿質中，低密度脂蛋白含量高達85%，是蛋黃凝膠過程中起主要作用的蛋白質，其他蛋白質并不直接參與蛋黃凝膠作用[17]；在WAKMATU等[18]人的研究中發(fā)現(xiàn)，當添加1%～2%NaCl時，形成低密度脂蛋白-水-NaCl復合物，會抑制低密度脂蛋白形成的凝膠，凝膠硬度、內(nèi)聚性等下降；同時在KITABATAKE等[19]人的研究中發(fā)現(xiàn)當NaCl濃度較高時，NaCl使凝膠中出現(xiàn)不溶性凝集物，凝膠強度下降。因此，當添加不同濃度的 NaCl時，維持低密度脂蛋白穩(wěn)定性的疏水相互作用被破壞，形成低密度脂蛋白-水-NaCl復合物，形成凝膠質構特性下降。

表1 不同NaCI濃度下蛋黃漿質凝膠質構 Table 1 Textural profiles of the egg yolk plasma gel with different concentration of NaCl treatment

2.3 NaCl處理對蛋黃漿質粒徑分布的影響

由圖2可知，0%、0.5%、1%、1.5%、2% NaCl添加量下蛋黃漿質粒徑分布情況。在 NaCl的添加量為0%時，粒徑呈現(xiàn)單峰分布，漿質粒徑分布在1～100 μm之間，分布較好；這和PILLET E等人測定的蛋黃漿質粒徑分布圖一致，均呈現(xiàn)較好單峰分布[17]；當加入NaCl后，逐漸出現(xiàn)兩個較小的峰，一個分布在1～10 μm，一個分布在100～1000 μm，粒徑分布圖峰向右移動，部分漿質蛋白發(fā)生聚集，粒徑變大；同時由于Na+的加入增加了蛋白的溶解性，部分蛋白粒徑變小，形成 1～10 μm 的小峰。

圖2 不同濃度NaCI處理蛋黃漿質粒徑分布圖 Fig.2 Particle size distribution of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

粒徑的分布反應了蛋黃漿質的穩(wěn)定性，Na+的作用使蛋黃的穩(wěn)定性破壞，當 NaCl濃度過高時，連接蛋黃顆粒高密度脂蛋白和卵黃磷蛋白的鈣磷橋被 Na+破壞，顆粒蛋白溶解度可達到80%以上，蛋黃稀釋靜置后漿質與顆粒形成較為明顯的分層，產(chǎn)生如圖4所示現(xiàn)象，在MCBEE L E等人最為經(jīng)典的蛋黃漿質與顆粒分離法中，選用0.17 M的NaCl作為稀釋劑[20]，可見一定濃度的NaCl會影響漿質溶液的穩(wěn)定性。

2.4 NaCl處理對蛋黃漿質色度影響

圖3 不同NaCI濃度下蛋黃稀釋靜置圖 Fig.3 Diluting statics of egg yolk solution with different concentration of NaCl treatment

從表2可以看出，隨著NaCl濃度的增加，蛋黃漿質明度L*增加，漿質顏色逐漸偏向紅黃色，其色澤整體變深。蛋黃的顏色是由于脂溶性類胡蘿卜素（葉黃素，包括玉米黃素、β-隱黃素以及少量的β-胡蘿卜素）的存在，其中脂類集中在蛋黃漿質中[21]，腌制會使蛋黃中脂質浸出，脂溶性類胡蘿卜素溶解量加大，漿質顏色由淡黃色變黃色、橙黃色，圖3中可以明顯看出蛋黃漿質色度變化。

蔣勁松對咸蛋黃分離腌制過程中，也發(fā)現(xiàn)蛋黃明度隨腌制時間延長、腌制液濃度增加，明度增加，是因為游離脂肪酸的析出[22]；吳玲部分替代 NaCl腌制對蛋黃色度的變化中，蛋黃顏色由鮮鴨蛋的亮黃色變紅黃后逐漸變暗變深，當咸蛋腌制成熟時，L*值變化較為緩慢[23]，咸蛋腌制完成；腌制過程中，NaCl的脫水作用也會使蛋黃色素變濃，顏色變深。不同 NaCl濃度下蛋黃漿質色度變化，反映了蛋黃在腌制過程中鹽濃度越高，游離脂肪酸析出越多，脂溶性類胡蘿卜素溶解增加，使得蛋黃漿質明度增加，顏色偏向紅黃色。漿質色度的變化體現(xiàn)著漿質中脂質變化、咸蛋腌制狀態(tài)，而脂質在蛋黃漿質凝膠網(wǎng)絡的形成中起到了填充作用，部分促進了凝膠品質形成。

表2 不同NaCI濃度下蛋黃漿質色度變化 Table 2 Values of L*, a* and b* colour coordinates for the eggs yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.5 NaCl處理對蛋黃漿質蛋白影響

通過SDS-PAGE凝膠電泳分析NaCl對蛋黃漿質蛋白條帶的影響。通過以標準蛋白的相對遷移做為對照，可以看出蛋黃漿質中主要為低密度脂蛋白和卵黃蛋白，分子量 175 ku、140 ku、70 ku、15 ku 為低密度脂蛋白的脫輔基蛋白質[24]，卵黃蛋白有三個異構體，分別為α、β、γ，分子量為 85 ku、42 ku、65 ku，這和AMANDA關于蛋黃漿質的SDS-PAGE圖一致[21]。蛋白樣品經(jīng)過 NaCl處理后，蛋白質條帶沒有明顯變化，說明實驗過程中 NaCl對蛋黃漿質的一級結構并不造成影響。鄭華等的研究也表明，腌制過程中盡管食鹽對蛋黃蛋白質的空間結構造成了一定程度的改變，但并未對蛋白質的肽鏈結構發(fā)生作用[6]；則NaCl處理，并未對蛋黃漿質凝膠蛋白質肽鏈結構造成影響。

圖4 不同NaCI濃度下蛋黃漿質SDS-PAGE圖 Fig.4 SDS-PAGE patterns of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.6 NaCl處理對蛋黃漿質流變特性影響

圖5為不同腌制濃度下蛋黃漿質的G’和G’的掃描頻率圖，對于某一確定粘彈性體系，G’與體系中交聯(lián)、纏結或聚集的彈性組分成比例；G’與體系中粘性成分有關；G’和 G’可作為評價粘彈性流體彈性以及粘性的大小。

圖5中蛋黃漿質所有樣品的G’和G’均隨著掃描頻率的增加而增加，且G’大于G’，可知蛋黃漿質是彈性流體，這和WANG YL等[26]人研究結果一致；圖5中蛋黃腌制時間24 h后，腌制蛋黃漿質儲能模量較新鮮蛋黃漿質均下降，NaCl濃度升高，腌制蛋黃漿質儲能模量升高，體系中交聯(lián)、聚集的彈性成分增加；損失模量在 NaCl的作用下變化較小，蛋黃漿質粘性降低較少。

在蛋黃漿質中含有較多的低密度脂蛋白，低密度脂蛋白懸浮在蛋黃溶液中，其具有形成凝膠的能力，當經(jīng)過一段時間的腌制后，咸蛋黃轉變?yōu)閺椥阅z[27]。KAEWMANEE等[28]人的研究中也發(fā)現(xiàn)，當NaCl添加量為1.5%時，蛋黃由溶膠轉變?yōu)槟z，蛋黃中漿質流變學行為發(fā)生變化。AMANDA[21]對新鮮蛋黃漿質中成分（lipidic paste）及顆粒進行了頻率掃描，發(fā)現(xiàn)其G’及G’同樣隨著掃描頻率的增加而增加，且tanδ小于1，呈現(xiàn)類固體的性質；因此，當NaCl腌制24 h處理后，蛋黃漿質凝膠G’和G’均低于未處理組，形成凝膠交聯(lián)程度降低，凝膠性能下降；而當 NaCl濃度增加至一定值時，形成凝膠交聯(lián)聚集彈性成分增加，凝膠性能相對增強。

圖5 不同NaCI濃度蛋黃漿質儲能模量（G′）與損失模量（G′′）變化 Fig.5 The changes of storage modulus (G’) and loss modulus(G’) of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

2.7 NaCl處理對蛋黃漿質凝膠微觀結構影響

不同濃度 NaCl處理，蛋黃漿質凝膠掃描電鏡圖（Scanning electron microscopy，SEM）如圖 6 所示，從圖中可以看出蛋黃漿質凝膠中不規(guī)則蛋白分布；NaCl添加量為0%時，凝膠中蛋白呈現(xiàn)較小的粒徑，當 NaCl添加量增加時，蛋黃漿質凝膠中部分蛋白顆粒粒徑變大，這和漿質粒徑測量是一致的（圖2）；當NaCl添加到蛋黃中，蛋黃中的脂質成分游離出來，覆蓋到蛋白表面，將蛋白中的孔洞填補，使得漿質凝膠表面更為緊縮、紋理粗糙，同時 NaCl的脫水作用使得這一現(xiàn)象更為明顯；AMANDA等[21]人的對新鮮蛋黃漿質組分的 SEM 圖中，脂質和蛋白在漿質組分中也呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀分布。

圖6 不同濃度NaCI處理蛋黃漿質掃描電鏡圖 Fig.6 Scanning electron microscopy of egg yolk plasma with different concentration of NaCl treatment

3 結論

本實驗通過對蛋黃分離腌制，運用多種分析檢測手段，分析 NaCl處理后蛋黃漿質色度、粒徑分布、流變性以及漿質蛋白分布，蛋黃漿質凝膠的保水性、凝膠質地結構特性以及凝膠微觀結構，來研究 NaCl處理對蛋黃漿質凝膠的影響。主要研究結果如下：隨著NaCl添加量由0%增加至2%，蛋黃漿質保水性隨NaCl濃度的增加而顯著增大（p＜0.05）；漿質凝膠硬度、咀嚼性、內(nèi)聚性均在 NaCl的作用下，凝膠系數(shù)下降，而彈性基本不變；流變學研究表明，蛋黃漿質是彈性流體，一定量 NaCl腌制后，蛋黃漿質凝膠性能下降；NaCl的作用會影響蛋黃漿質粒徑分布，使部分蛋白分子產(chǎn)生聚集，粒徑變大；而對蛋白質肽鏈結構并不造成影響；NaCl處理后蛋黃漿質中蛋白、脂質隨著鹽的不斷滲入，蛋黃脫水，脂質不斷分解，凝膠結構發(fā)生改變，蛋白粒徑變大，結構粗糙，而游離出來的脂質會使凝膠中蛋白顆粒包裹起來形成皺縮狀態(tài)。因此，0.5%、1%、1.5%、2%濃度NaCl腌制蛋黃，不僅降低了蛋黃漿質形成凝膠質構特性，而且形成凝膠特性下降。