酶法制備葛根素的丙酯衍生物

袁亭亭，李曉鳳，袁琨

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.乳業(yè)生物技術(shù)國家重點實驗室，廣東廣州 510640）

葛根素有多種生理活性，在臨床上主要用于治療冠心病、高血壓、心絞痛和心率失常等心血管方面疾病，且已顯現(xiàn)出較好的療效；除此之外，葛根素還可以增加腦血流量，促進人體腦循環(huán)，因此，常用于治療腦動脈硬化、短暫腦缺血發(fā)作等腦血管疾病，且療效極佳[1,2]。然而，由于其結(jié)構(gòu)是異黃酮結(jié)構(gòu)，脂溶性 較差，造成其生物利用度較低[3]。已有研究表明，通過對黃酮類化合物的?；揎椏梢杂行岣咂渲苄裕M而能夠增強其生物利用率[4]。

目前可以對黃酮化合物?；揎椀姆椒ㄓ袀鹘y(tǒng)的化學(xué)法和酶催化的方法，但是采用常規(guī)化學(xué)法對黃酮化合物進行選擇性的?；揎椧话阋?jīng)過基團保護、酯化、脫保護基團等處理，此類方法步驟繁雜，引入溶劑較多；利用酶法催化黃酮類化合物的酰化反應(yīng)可以避免上述這些問題。脂肪酶，即三酰甘油酯水解酶（EC3.1.1.3），是一類具有特殊性質(zhì)的酯酶，能在水不溶性體系或油水界面進行催化反應(yīng)，具有立體選擇性、對映選擇性、底物專一性等諸多特點[5]。脂肪酶在有機溶劑體系和水體系中都具有較高的穩(wěn)定性和有效性，是一種非常重要的生物催化劑。在非水相介質(zhì)中，脂肪酶能催化水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，主要包括酯化反應(yīng)和酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)（酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)和酸解反應(yīng)）等合成型反應(yīng)[6,7]。

基于上述研究現(xiàn)狀，本研究探討了酶催化葛根素?；磻?yīng)的可行性，從8種水解酶中篩選出能高效催化葛根素丙?；磻?yīng)的生物酶制劑；探討了有機溶劑的種類、反應(yīng)時間、水分含量和底物摩爾比等反應(yīng)參數(shù)對葛根素丙酰化反應(yīng)的影響規(guī)律；并通過高效液相色譜、質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜等技術(shù)對所制備的黃酮酯類產(chǎn)物進行了結(jié)構(gòu)鑒定，進一步確定了產(chǎn)物主要是葛根素丙單酯。

1 材料與方法

1.1 材料

Novozym 435，來源于Candida Antarctica，type B；LipozymeIMTL，來源于Thermomyces lanuginosus；LipozymeIMRM，來源于Rhizomucor miehei；Novozym 435、LipozymeIMTL、LipozymeIMRM、豬胰脂肪酶、CRL酶均購自諾維信公司；胰脂肪酶、肽酶、胃蛋白酶來自華南理工大學(xué)蛋白中心贈送。

葛根素購自上海Aladdin公司；丙酸乙烯酯（VP），購自美國Sigma公司；甲醇，購自德國Merck公司，色譜純；四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、叔丁醇、乙腈、異丙醇、2-甲基四氫呋喃、石油醚、異辛烷、甲醇均購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司，均為市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Waters高效液相色譜儀，配備600控制器、2996光電二極管矩陣PDA紫外檢測器、717 Plus自動進樣器。色譜柱：4.6×250 mm(5 μm) Zorbax SB-C18 分析型色譜柱（Agilent Technologies Co, Ltd, USA）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號：7890A/5975C，美國安捷倫公司；Bruker AV600型核磁共振儀，瑞士布魯克公司；移液槍（20 μL、100 μL、200 μL、1 mL 和 5 mL）：德國Eppendorf公司；FA2204B電子天秤：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TW-3021HR冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；高速離心機，美國Thermo公司；HZQ-F100全溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱。

1.3 實驗方法

1.3.1 不同種類酶催化葛根素酯合成反應(yīng)

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP），分別相應(yīng)地加40 mg/mL酶，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃、200 r/min）。定時取樣 100 μL，12000 r/min離心5 min后，取20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，液相色譜自動進樣器進樣20 μL，供分析。

1.3.2 反應(yīng)初速度、底物轉(zhuǎn)化率、區(qū)域選擇性的計算[8]

1.3.2.1 反應(yīng)初速度 V0值（Initial rate，mmol/(L·h)）

根據(jù)反應(yīng)開始階段，單位時間內(nèi)葛根素的減少量來計算初始反應(yīng)速度：反應(yīng)初速度V0(mmol/(L·h))=(A0-Ai)/t。

其中：A0、Ai分別表示反應(yīng)前后葛根素的濃度（mmol/L），t為反應(yīng)時間（h）。

1.3.2.2 底物轉(zhuǎn)化率（Conversion，%）

根據(jù)底物反應(yīng)前后葛根素的峰面積的差值與反應(yīng)前葛根素峰面積之比值來計算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率C(%)=(S0-Si)/S0×100%。

其中：S0、Si分別表示反應(yīng)前后葛根素的峰面積。

1.3.2.3 區(qū)域選擇性（Regioselectivity，%）

根據(jù)目的?；a(chǎn)物的峰面積與所有?；a(chǎn)物的峰面積之比值來計算反應(yīng)的區(qū)域選擇性：

區(qū)域選擇性Regioselectivity(%)=Wi/Wtotal

其中：Wi表示目的?；a(chǎn)物的峰面積，Wtotal表示所有?；a(chǎn)物的峰面積之和。

1.3.3 高效液相色譜（HPLC）分析

儀器：Waters高效液相色譜儀：配備PDA紫外檢測器；檢測波長為254 nm；色譜柱：4.6×250 mm，5 μm Zorbax SB-C18 分析型色譜柱。

流動相：63%甲醇-水溶液（含0.1%冰醋酸）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.4 產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

利用薄層色譜（TLC）對產(chǎn)物進行分離純化。首先，將含有機溶劑的反應(yīng)混合物在 10000 r/min下離心，除去脂肪酶催化劑，取上層反應(yīng)溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行真空減壓蒸餾，懸蒸2～3次，得到粗產(chǎn)物，溶解于一定量的甲醇中，完全溶解后，經(jīng)15000 r/min離心后，取上清液。利用薄層色譜對產(chǎn)物進行分離純化，首先在GF254 25×75 mm硅膠板上確定展開劑比例，再在GF254 100×200 mm的制備板上點樣，每次點樣1 μL，重復(fù)點樣3～5次。薄層層析結(jié)束后，用紫外燈（254 nm）觀察底物和產(chǎn)物條帶，收集含有產(chǎn)物的硅膠顆粒，用甲醇溶解，溶液離心后，取上清液。最后，真空干燥24 h得到葛根素酯。

葛根素和丙酸乙烯酯的反應(yīng)產(chǎn)物，用氯仿/甲醇/水=8/2/0.3(V/V/V)作為層析液。產(chǎn)物經(jīng)過分離純化，并通過HPLC進行純度鑒定后，用超高分辨飛行時間質(zhì)譜（TOF-MS）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）進行結(jié)構(gòu)分析。

FT-IR檢測：稱取1～2 mg經(jīng)過TLC純化的葛根素酯產(chǎn)物，與200 mg左右的溴化鉀研磨均勻，置于模具中，用壓片機將樣品壓成透明薄片，將產(chǎn)物樣品放到樣品架上，置于紅外光譜儀上分析，以葛根素為對照組。

1.3.5 反應(yīng)介質(zhì)對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在多個5 mL帶塞三角瓶中分別加入1 mL二甲基亞砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙腈（acetonitrile）、甲醇（methanol）、2-甲基四氫呋喃（2-Me THF）、四氫呋喃（THF）、叔丁醇（tert-Butanol）、異丙醇（isopropanol）、石油醚（petroleum）和異辛烷（isooctane），再依次加入 20 mmol/L 葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP），混合均勻。加入40 mg/mL Novozym 435催化劑后，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃，200 r/min）。定時取樣 100 μL，12,000 r/min離心5 min后，取20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進樣20 μL，進行檢測與分析。

1.3.6 反應(yīng)時間對酶催化葛根素?；磻?yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP）和2 mg/mL Novozym 435催化劑混合均勻，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃、200 r/min）。定時取樣 100 μL，12000 r/min 離心 5 min 后，取 20 μL 上清液，用 63%甲醇-水溶液稀釋50倍，液相色譜自動進樣器進樣20 μL，供分析。

1.3.7 水分含量對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20

mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯，混合均勻；再分別添加 0 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL、30 μL/mL、50 μL/mL；加入 2 mg/mL Novozym 435 催化劑開始反應(yīng)，置于氣浴恒溫?fù)u床上振蕩（40 ℃，180 r/min）。定時取樣，12000 r/min 離心 5 min 后取 20 μL 上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進樣20 μL，進行檢測與分析。

1.3.8 底物摩爾比對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素，分別加入100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L、700 mmol/L、800 mmol/L 丙酸乙烯酯（VP），混合均勻。加入 2 mg/mL Novozym 435 催化劑后，開始反應(yīng)，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃，200 r/min）。定時取樣 100 μL，12000 r/min 離心 5 min 后，取 20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進樣20 μL，進行檢測與分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析，所有數(shù)據(jù)取三次重復(fù)的平均值；用Origin 8.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合以及圖形化處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脂肪酶催化葛根素酯合成反應(yīng)

為了篩選到能高效催化葛根素酰化反應(yīng)的酶生物催化劑，以有機溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，研究了3種固定化脂肪酶、3種游離脂肪酶、1種肽酶和1種胃蛋白酶在該?；磻?yīng)中的催化效果。值得一提的是，從表1看，并非所有酶制劑都能高效催化葛根素的?；磻?yīng)。這主要是因為它們是不同來源具有底物[9,10]不同的識別特征的生物催化劑。

表1 不同酶催化葛根素丙?；姆磻?yīng)aTable 1 Acylation of puerarin with VP catalyzed by different lipasea

酶制劑是酶經(jīng)過提純、加工后的具有催化功能的生物制品，一般具有較高的底物選擇性，該特性與酶結(jié)構(gòu)、種類及其來源密切相關(guān)。表2表明，不同來源的酶對葛根素丙?；磻?yīng)呈現(xiàn)出不同的催化活力。對葛根素丙?；磻?yīng)來說，不同來源的脂肪酶均具有良好的催化活性。其中，采用固定化脂肪酶 LipozymeIMTL、LipozymeIMRM時，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上，初始速度分別為 19.64 mmol/L 和 24.56 mmol/L；Novozym 435也可以高效催化葛根素丙酰化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率和初始速度分別為99.8%和25.0 mmol/L。采用2種游離脂肪酶的做催化劑時反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高；其中采用豬胰脂肪酶時轉(zhuǎn)化率為67%，與固定化脂肪酶相比，催化效果不理想；肽酶和胃蛋白酶在非水相酶催化葛根素丙?；磻?yīng)中沒有表現(xiàn)出催化活性。

2.2 酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的高校液相色譜分析

圖1 Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)前(a)后(b)色譜圖Fig.1 Chromatograms of samples before (a) and after (b)acylation of puerarin catalyzed by Novozym 435

在本研究中，我們用 4.6×250 mm(5 μm)Zorbax SB-C18 分析型色譜柱（Agilent Technolgies Co, Ltd, USA），63%甲醇-水（水中含 0.1%乙酸），流速 0.5 min/mL，獲得了良好的底物和產(chǎn)物分離效果。在254 nm下可檢測葛根素及酯。如圖1所示，為葛根素反應(yīng)前后液相色譜圖，其中峰1為葛根素保留時間分別是11.6 min，反應(yīng)后在15.9 min位置出現(xiàn)了明顯的產(chǎn)物峰2，反應(yīng)后在20.9 min位置出現(xiàn)了明顯的產(chǎn)物峰3，從圖中很明顯可以看出葛根素單酯的色譜峰比較高，選擇性為98%。經(jīng)過薄層層析等分離純化過程，該產(chǎn)物被純化出來進行了進一步的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.3 酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的質(zhì)譜和紅外光譜分析

圖2 葛根素單酯（a）和葛根素雙酯（b）的高分辨率質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of PME (a) and PDE (b)

質(zhì)譜法是利用電場和磁場將運動的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法，測出離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成。圖2是葛根素單酯（a）和葛根素雙酯（b）的高分辨率質(zhì)譜圖。從圖中分析結(jié)構(gòu)顯示，能檢測到與葛根素單酯（C24H24NaO10，495.13m/z[M+Na]+）和葛根素雙酯（C27H28NaO11，551.15m/z[M+Na]+）的相對分子量。根據(jù)物質(zhì)對不同波長的紅外輻射的吸收特性，進行分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分分析，所以利用FT-IR能有效鑒定出官能團或化學(xué)鍵的存在或變化。圖3是葛根素（a）和葛根素酯（b）的傅里葉紅外光譜圖。相較于圖3 a，在圖3 b中1718 cm-1和2900 cm-1處出現(xiàn)了新的羰基伸縮振動吸收峰，分別為C=O特征峰（酯的典型吸收峰）和C-H特征峰，由此確定在葛根素結(jié)構(gòu)中加入丙酸酯基。

圖3 葛根素（a）及其酯（b）的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 The FT-IR graph of Puerarin (a) and its esters (b)

2.4 反應(yīng)介質(zhì)對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

有機溶劑體系是影響黃酮類化合物合成的一個重要因素，它通過改變酶的活性和穩(wěn)定性，影響反應(yīng)的初始速率和轉(zhuǎn)化率[11]。同樣，脂肪酶催化劑也顯示溶劑依賴性和細(xì)胞活性在不同有機溶劑體系變化較大[12,13]。因此，我們對不同有機溶劑系統(tǒng)對Novozym 435催化劑葛根素?；呋钚缘挠绊戇M行了研究。

在前期實驗中，我們發(fā)現(xiàn)強極性有機溶劑能較好地溶解葛根素，但據(jù)報道，強極性有機溶劑會奪取酶活性中心的必需水，使之失去活力[14,15]。正如我們所預(yù)期的那樣（如表2所示），在強極性有機試劑DMSO和DMF中，葛根素有很高的溶解度，但Novozym 435在催化葛根素丙酰化反應(yīng)中，并沒有表現(xiàn)出催化活性；在一般極性的異丙醇、叔戊醇有機溶劑體系中，Novozym 435催化劑表現(xiàn)出很低的催化活性，在反應(yīng)24 h時，轉(zhuǎn)化率分別僅為10.3%和8.7%。除了強極性有機溶劑對酶活性的影響，也可能與溶劑溶解底物的能力有關(guān)，也就是說底物分子葛根素很難離開反應(yīng)介質(zhì)進入酶的活性部位，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低[16]。因此，在DMSO和DMF反應(yīng)介質(zhì)完全失去了Novozym 435催化劑的活性，而在異丙醇、叔丁醇反應(yīng)介質(zhì)中保持一點催化活力。

Novozym 435在催化葛根素丙?；磻?yīng)中，在有機溶劑THF和2-Me THF表現(xiàn)出很高的催化活性，轉(zhuǎn)化率分別為98.7%和97.5%，又因為葛根素在THF溶劑中比2-Me THF溶劑有較好的溶解度，Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)中，選擇有機試劑THF為最優(yōu)的試劑。

表2 不同有機溶劑對Novozyme 435催化葛根素酰化反應(yīng)影響aTable 2 Effect of pure organic solvents on acylation of puerarin catalyzed by Novozyme. 435 lipasea

2.5 反應(yīng)時間對酶催化葛根素?；磻?yīng)的影響

從圖4可以看出，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時間的增加而增加。在反應(yīng)0～3 h時間內(nèi)，酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率急劇上升，這是由于反應(yīng)初始階段葛根素與丙酸乙烯酯濃度較高且產(chǎn)物濃度較低，反應(yīng)向正向進行；反應(yīng)3～6 h時間內(nèi)，酶促反應(yīng)速度不斷下降底物轉(zhuǎn)化率逐漸趨緩；在反應(yīng)6 h左右，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%，然后通過進一步延長反應(yīng)時間，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率幾乎沒有改變，反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，通過Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)達(dá)到熱力學(xué)平衡狀態(tài)時，反應(yīng)時間為6 h，值得一提的是，在這項研究中，Novozym 435催化葛根素丙酰化反應(yīng)中獲得的轉(zhuǎn)化率高于以往的研究報道。我們可以得出結(jié)論，Novozym 435催化劑能高效催化葛根素丙酰化反應(yīng)。

圖4 反應(yīng)時間對Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)的影響Fig.4 Effect of time on acylation of puerarin by Novozyme. 435

2.6 水分含量對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

圖5 水分含量對Novozym 435催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of water content on acylation of puerarin by Novozyme. 435

很多研究認(rèn)為酶分子需要一定的水分來保持酶的活性與反應(yīng)的進行，但是高水分會使酶分子結(jié)合導(dǎo)致反應(yīng)速率的大幅度下降[17]，所以說，酶分子水分含量需要保持在一個很窄的范圍內(nèi)。一般研究水分對反應(yīng)的影響有兩種方法，一是研究水分活度aw來確定最佳水分用量[18,19]，二是溶劑中添加的水分的含量，這種方法操作方便，特別是適用于工業(yè)應(yīng)用，便于操作[19,20]；本研究中也采用水分體積含量考察水對脂肪酶催化葛根素丙酰化反應(yīng)的影響。從圖5中可以看出反應(yīng)初速度與轉(zhuǎn)化率都是隨著水分含量的增加呈現(xiàn)遞減的；但是區(qū)域選擇性沒有發(fā)生較大變化。對于該催化反應(yīng)體系來說，水分的存在反而會降低酶的活性，水分含量為0，Novozym 435催化葛根素酰化反應(yīng)的催化效率最高。

2.7 底物摩爾比對酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

圖6 底物摩爾比對Novozym 435催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of molar ration of substrate on acylation of puerarin by Novozyme. 435

轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是一個可逆反應(yīng)，即葛根素的轉(zhuǎn)酯合成與酯的水解會同時發(fā)生。當(dāng)一種反應(yīng)底物過量時，有利于熱力學(xué)平衡向酯合成方向進行。本研究考察了丙酸乙烯酯與葛根素的摩爾比對Novozym 435催化葛根素丙?；磻?yīng)的影響（圖 6）。VP/葛根素的摩爾比從5增加到30（mol/mol），反應(yīng)速率和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率顯著提高，區(qū)域選擇性變化不大。VP/葛根素的摩爾比從30增加到40（mol/mol），反應(yīng)速率和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率幾乎沒有變化，區(qū)域選擇性變化不大。因此，綜合考慮轉(zhuǎn)化率和底物摩爾比之間的關(guān)系，我們選擇 30:1（VP:葛根素（mol/mol））作為該反應(yīng)的最佳底物摩爾比，此時葛根素的?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率為99.5%，初始速度22.1 mmol/(L·h)。

3 結(jié)論

本研究從8種不同種類的水解酶中篩選可以高效催化葛根素丙?；磻?yīng)的酶，成功篩選到3種脂肪酶能高效催化非水相葛根素丙酰化反應(yīng)，并以脂肪酶Novozym 435催化葛根素丙?；磻?yīng)為模型，研究了反應(yīng)時間、有機溶劑種類、水分含量、底物摩爾比等對該模型的影響規(guī)律。研究結(jié)果表明：選擇以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，2 mg/mL Novozym 435脂肪酶，底物：?；w之比為1:30，轉(zhuǎn)速200 r/min，水分含量為0的反應(yīng)條件下，反應(yīng)6 h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.5%。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化后進行了結(jié)構(gòu)鑒定，高效液相色譜、質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜結(jié)果表明，非水相酶催化葛根素?；磻?yīng)，所得產(chǎn)物酯為葛根素丙單酯，區(qū)域選擇性達(dá)98%。Novozym 435可以快速、高效催化葛根素丙?；磻?yīng)，本研究工作將為脂肪酶Novozym 435為代表的生物催化劑在黃酮類化合物中的?；揎椃磻?yīng)提供理論依據(jù)。