丹參素上調(diào)LCAT和CYP7A1的表達對高血脂大鼠脂質(zhì)紊亂的調(diào)節(jié)作用

李士俠（棗莊科技職業(yè)學院職教中心，山東滕州 277599）

高脂血癥（hyperlipdemia，HLP）是一種或幾種脂類代謝失調(diào)誘導的血液中脂質(zhì)代謝紊亂的疾病[1]。隨著生活質(zhì)量的提高，中老年人高蛋白、高脂飲食日益增多，加上運動量減少，血中脂肪無法代謝而積累，最后發(fā)展為高血脂。大量研究證實[2,3]，高血脂是誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化和心肌梗死等疾病的主要危險 因素。流行病學數(shù)學顯示[4]，血液中總膽固醇和低密度脂蛋白濃越高，罹患心腦血管疾病的危險性就越高。因此，積極治療并預防HLP對減少心腦血管疾病的發(fā)生有重要意義。高脂血癥藥物治療研究表明[5]，有效的降脂治療可顯著改善冠心病患者的病情，提高生活質(zhì)量。然而，當下HLP治療藥物如他汀類、貝特類等調(diào)脂藥，不良反應限制了臨床應用。因此開發(fā)尋找新的、安全的、有效的降脂藥十分必要。

丹參作為中藥常與他汀類降脂藥聯(lián)合應用治療心血管疾病，其活性成分包括脂溶性的丹參酮和水溶性的丹參素。丹參素（salvianic acid，SA）是一種芳香酸類化合物，化學名D-(+)-β-(3,4二羥基苯基)乳酸[6]，具有抑制心肌肥大[7]、抗動脈粥樣硬化[8]、抗肝纖維化[9]及抗癌[10]等多種藥理活性。但是丹參素是否具有降脂作用，對抗血脂紊亂導致的低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）上調(diào)，具體作用機制如何尚未有明確的報道。血清中膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及載脂蛋白等是反應機體脂質(zhì)代謝的常見指標。上述代謝指標異常導致血脂代謝紊亂繼而發(fā)生高血脂癥，血液粘稠度增加，形成脂肪栓等附著于血管壁，極易誘發(fā)冠心病、心肌梗死等心腦血管疾病。從中藥材中尋找有效單體成分治療高血脂癥，預防心腦血管疾病的發(fā)生成為近年來的研究熱點。

因此，本文將構(gòu)建高血脂大鼠模型，給予丹參素干預治療，探究丹參素這一單體物質(zhì)能否改善高血脂癥，是否通過上調(diào)卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）和膽固醇 7α-羥化酶蛋白（CYP7A1）發(fā)揮降脂作用，現(xiàn)具體報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠，體重220±10 g，購自武漢大學動物實驗中心，合格證[SCXK(鄂)2008-0004]。室內(nèi)溫度控制在24±2 ℃，大鼠自由飲食飲水適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 儀器

全自動生化儀，PRONTO EVOLUTION，意大利；UV-1601紫外風光光度計，日本島津；飛鴿牌離心機，F(xiàn)A1004分析天平；羅氏480熒光定量PCR儀，美國Roche公司；免疫印跡電泳系統(tǒng)，Bio-Rad。

1.3 藥物與試劑

丹參素（sigma，其純度＞98.0%），總膽固醇試劑盒（TC）、甘油三酯試劑盒（TG）低密度脂蛋白膽固醇試劑盒（LDL-C）高密度脂蛋白膽固醇試劑盒（HDL-C）、載脂蛋白 AI試劑盒（apoAI）和載脂蛋白B試劑盒（apoB）均購于南京建成生物工程研究所；卵磷脂膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）、膽固醇 7α-羥化酶蛋白（CYP7A1）和β-actin抗體均購自Abcam公司；BCA試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所；LCAT和CYP7A1引物由美國Invitrogen公司合成；TRIzol總RNA提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；cDNA Kit合成試劑盒自羅氏公司。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

40只SD大鼠隨機分為正常對照組（S）、高血脂癥模型組（M）、丹參素高劑量組（20 mg/kg，SAH）和丹參素低劑量組（10 mg/kg，SAL），每組10只。正常組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，其他組根據(jù)文獻給予高脂飼料喂養(yǎng)8周，建立大鼠高脂血癥模型[11,12]，邊造模邊灌胃給藥。每日灌胃給藥1次（1.0 mL/100 g），連續(xù)給藥8周，正常對照組和模型組給予等量的生理鹽水。8周后，每組大鼠腹主動脈取血，同時采集肝臟標本，進行各項指標的檢測。

1.4.2 血脂測定

根據(jù)試劑盒說明書測定各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、apoAI和apoB含量。

1.4.3 實時定量PCR檢測

稱取 50 mg大鼠肝臟，利用 TRIzol法提取總RNA，然后將1 μg總RNA通過cDNA Kit試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR在LightCycler@480(Roche公司)設備中進行，每個樣品設置 3個重復，并以GAPDH作為內(nèi)參測定。定量PCR特異產(chǎn)物通過溶解曲線分析，以2-ΔΔCT表示相對基因表達變化。用于定量PCR的引物序列如下。

表1 實時定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences of real-time PCR

1.4.4 免疫印跡Western-blot檢測

蛋白裂解液提取肝臟組織蛋白樣品，BCA法檢測樣品蛋白含量并調(diào)節(jié)蛋白濃度至相同，加入5×上樣緩沖液沸水浴10 min，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μL蛋白樣品上樣，SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉。分別如LCAT、CYP7A1和β-actin抗體4 ℃孵育過夜，次日加入二抗室溫孵育后 ECL法曝光顯色。

1.4.5 肝臟組織病理學形態(tài)檢測

采集各組大鼠肝臟組織 4%多聚甲醛固定后，行石蠟包埋切片，HE染色，觀察肝臟病理學變化。

1.5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，先進行數(shù)據(jù)的正態(tài)分布檢驗，方差齊性檢驗，計量數(shù)據(jù)用±s表示，組間差異用單因素方差分析，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 丹參素對高血脂模型大鼠血脂水平的影響

有研究顯示[13]，高脂血癥的形成與血液中 TC、TG、LDL-C正相關(guān)，與HDL-C負相關(guān)；當血脂發(fā)生異常時，TC水平升高會沉積于血管壁上，TG含量增加可能激活凝血機制，促進血栓的形成，進而誘導動脈粥樣硬化或是冠心病的發(fā)生。同時，LDL-C參與將肝臟中的TC轉(zhuǎn)運至肝外組織，而HDL-C則是將肝外的TC轉(zhuǎn)運到肝臟分解，代謝為膽汁酸。

本研究實驗結(jié)果如表2所示，8周后模型組大鼠血清中TC、TG、LDL-C含量分別升高至13.63±2.47 mmol/L、3.56±0.59 mmol/L 及 10.12±1.76 mmol/L，同時HDL-C水平下降至0.21±0.09 mmol/L，和正常組比較差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01），說明高血脂造模成功。給予丹參素灌胃治療后，高劑量 SAH組大鼠血清中TC、TG和LDL-C的含量分別為6.56±3.49 mmol/L、1.77±33.15 mmol/L 及 5.31±1.07 mmol/L，低劑量 SAL組上述指標則分別降低至 9.34±4.07 mmol/L、2.25±28.69 mmol/L 及 6.63±1.46 mmol/L；與此同時，SAH 組和 SAL組 HDL-C含量升高至 0.69±0.11 mmol/L和0.52±0.13 mmol/L，和模型組比較有統(tǒng)計學差異（p＜0.01或p＜0.05）。這一結(jié)果表明，丹參素能顯著逆轉(zhuǎn)高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDL-C水平的上升和 HDL-C含量的下降；其中高劑量組降脂效果優(yōu)于低劑量組，進一步說明丹參素具有促進 HDL-C上調(diào)加快肝外組織TC、TG的轉(zhuǎn)運及降解的作用，且存在一定的量效關(guān)系。

在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運及代謝過程中，載脂蛋白是一類具有特殊作用的脂蛋白，其維持了脂蛋白的結(jié)構(gòu)并參與了運輸，具有代表性的就是apoAI和apoB，不僅調(diào)空了有關(guān)代謝酶的活性，還是細胞表面脂蛋白受體的相關(guān)配體參與了脂蛋白代謝調(diào)節(jié)過程[14]。apoAI是高密度脂蛋白（HDL）的載體蛋白，具有清除肝外組織中游離膽固醇的作用。HDL-C將肝外游離TC轉(zhuǎn)運至肝臟進行分解，卵磷脂膽固醇脂酰基轉(zhuǎn)移酶（LCAT）是這一代謝過程的關(guān)鍵酶。

apoAI水平的升高可激活LCAT活性，進一步促進TC的清除代謝。早期有報道，apoAI的上調(diào)能抑制動脈粥樣硬化的形成[14]。apoB是LDL的載脂蛋白，可刺激血管平滑肌的增生，加速細胞內(nèi)膽固醇的酯化過程，促使LDL-C沉淀。本研究結(jié)果證實，M組大鼠血清中 apoB水平上升至正常組的近 2倍，為0.59±0.01 g/L，apoAI水平則明顯下降至 0.19±0.01 g/L（p＜0.01），高血脂癥大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，載脂蛋白apoAI下調(diào)，apoB上調(diào)使得HDL和LDL轉(zhuǎn)運失衡，TC、TG清除減慢，加劇了酯化過程。丹參素干預后，SAH組和SAL組大鼠血清中apoAI增加至0.24±0.01 g/L 和 0.22±0.00 g/L，apoB 下降至 0.41±0.01 g/L 和0.48±0.02 g/L，與 M 組比較差異有統(tǒng)計學意義（p＜0.01或p＜0.05）。丹參素可以調(diào)節(jié)載脂蛋白 apoAI上調(diào)及apoB下調(diào)，加快HDL-C對肝外游離TC的轉(zhuǎn)運，逆轉(zhuǎn)LDL-C的沉積，促使血脂代謝趨向于正常。

表2 丹參素對大鼠血脂TC、TG、LDL-C、HDL-C、apoAI及apoB含量的影響Table 2 The influence of Salvianic acid on the contents of TC, TG, LDL-C, HDL-C, apoAI and apoB in rats with the hyperlipidemia

2.2 丹參素對高血脂模型大鼠肝臟脂質(zhì)關(guān)鍵代謝酶的調(diào)控作用

LCAT作為游離TC轉(zhuǎn)運至肝臟分解代謝的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)機體膽固醇平衡具有重要作用[15]。膽固醇7α-羥化酶蛋白CYP7A1是膽汁酸合成的經(jīng)典限速酶，游離的TC被轉(zhuǎn)運到肝臟后需要在限速酶CYP7A1的作用下分解為膽汁酸才能排除體外[16]。血脂代謝紊亂發(fā)生高血脂癥后，肝組織LCAT和CYP7A1水平會下調(diào)，如圖1所示，模型組大鼠建模后肝臟組織中LCAT和CYP7A1mRNA表達量顯著降低至正常組的1/2到1/3（p＜0.01），這與其他報道結(jié)果一致。丹參素干預后，SAH組和 SAL組大鼠肝組織 LCAT、CYP7A1mRNA表達水平與模型組比較明顯增加，增加至模型組的近2倍（p＜0.05或p＜0.01）。高劑量組LCAT、CYP7A1mRNA表達水平回升接近正常對照組，表明丹參素逆轉(zhuǎn)肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶基因的下調(diào)。

圖1 丹參素對高血脂大鼠肝臟LCAT和CYP7A1基因mRNA的調(diào)控作用Fig.1 The regulation effect of Salvianic acid on the mRNA expressions of LCAT and CYP7A1 in rats with the hyperlipidemia

圖2 丹參素對高血脂大鼠肝臟LCAT和CYP7A1蛋白的調(diào)控作用Fig.2 The regulation effect of Salvianic acid on the protein expressions of LCAT and CYP7A1 in rats with the hyperlipidemia

此外，本研究還采用免疫印跡評估了各組大鼠肝組織中LCAT和CYP7A1蛋白的表達。由圖2可知，模型組大鼠肝臟組織中LCAT和CYP7A1表達量較正常組減少近60%（p＜0.01），這一結(jié)果和血清中各血脂指標變化相符合。給予丹參素治療后，SAH組和SAL組大鼠肝組織LCAT、CYP7A1表達量與模型組比較明顯增加（p＜0.05或p＜0.01）；尤其是高劑量組LCAT、CYP7A1蛋白表達量是模型組的2倍，接近正常組水平，效果優(yōu)于低劑量組。丹參素可以通過上調(diào)高血脂大鼠肝組織LACT和CYP7A1的表達，促進HDL-C對肝外游離TC轉(zhuǎn)運作用，加快TC分解膽汁酸排除，發(fā)揮逆轉(zhuǎn)血脂升高作用，降至效果呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.3 丹參素對高脂血癥大鼠肝組織保護作用

肝臟是脂蛋白代謝的重要場所，當血脂含量升高，膽固醇和甘油三酯堆積易誘導肝細胞腫脹、破裂、壞死。圖3可知，正常組大鼠肝組織HE染色顯示肝細胞結(jié)構(gòu)較為完整一致，未見脂肪病變（圖 3a）。模型組大鼠肝組織HE可見肝細胞破裂，形態(tài)不完整，排列紊亂，細胞間隙出現(xiàn)大量空泡，發(fā)生脂肪病變，且有炎性細胞親潤（圖 3b）。高血脂模型組大鼠肝細胞可見明顯的脂肪病變，肝細胞胞漿疏松化，呈現(xiàn)嚴重的氣球樣變，這與Liu等[17]人的研究結(jié)果一致。給予丹參素干預后，SAH組（圖3c）及SAL組（圖3d）肝細胞有輕度脂肪變形，與模型組比較病變明顯減輕，正常完整的肝細胞數(shù)目增多，高劑量組大鼠肝組織病 理改善結(jié)果優(yōu)于低劑量組，丹參素具有逆轉(zhuǎn)肝細胞腫脹、脂肪病變的作用。

3 結(jié)論

綜上所述，丹參素具有降低高脂血癥模型大鼠血脂水平的作用，其作用機制可能增加肝組織LCAT和CYP7A1基因和蛋白的水平，上調(diào)載脂蛋白apoAI及下調(diào)apoB，促進HDL-C的轉(zhuǎn)運作用，清除TC、TG和LDL-C，更具體作用信號通路機制待進一步探究。