氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的防效及其對(duì)煙株生長(zhǎng)的影響

任曉芬，亓文哲，程星凱，劉政軍，姬小雪，喬康

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018;2 山東泰陽(yáng)生物科技有限公司，山東泰安 271000

煙草黑脛病（Tobacco black shank）是由寄生疫霉（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）引起的危害煙草生產(chǎn)的重要病害，嚴(yán)重影響烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量[1]。當(dāng)前防治煙草黑脛病的主要措施仍為化學(xué)防治，如常規(guī)藥劑甲霜靈和烯酰嗎啉等[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)殺菌劑在長(zhǎng)期、高頻率使用下，對(duì)煙草黑脛病防效顯著降低，病原菌已對(duì)其產(chǎn)生不同程度的抗藥性[3]。因此，為保障煙葉生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展，亟需篩選出具有新作用機(jī)理的殺菌劑替代當(dāng)前常規(guī)藥劑。

氟菌·霜霉威（62.5 g/L氟吡菌胺+625 g/L霜霉威鹽酸鹽）是由德國(guó)一家公司研發(fā)的酰胺類(lèi)復(fù)配劑。氟吡菌胺的穿透性、傳導(dǎo)性強(qiáng)，對(duì)病原菌的各形態(tài)均表現(xiàn)出很好的抑制作用[4]。霜霉威鹽酸鹽可以被植株葉片和根系快速吸收，在植株體內(nèi)的上下傳導(dǎo)，能為植株的葉片、根莖等提供全面保護(hù)[5]。閆磊等[6]曾報(bào)道，氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑混用可有效防治黃瓜霜霉病，且防效優(yōu)于單獨(dú)施用。目前，氟菌·霜霉威在煙草上處于試驗(yàn)（試用）階段，尚未正式登記，其對(duì)黑脛病的防治效果有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)通過(guò)室內(nèi)毒力和溫室盆栽試驗(yàn)明確氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的防效及其對(duì)煙株生長(zhǎng)、煙草葉片防御酶活性的影響，探明氟菌·霜霉威作為替代藥劑用于防治煙草黑脛病的潛力，為其合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌

煙草黑脛病菌采集自山東濰坊、泰安、臨沂3地的煙草病株，本研究根據(jù)許學(xué)明[7]建立的煙草黑脛病菌對(duì)甲霜靈的敏感性基線，得出所采集的煙草黑脛病菌株的抗性倍數(shù)在3.15～42.77之間。參照戰(zhàn)徊旭等[8]對(duì)菌株敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)，篩選出對(duì)甲霜靈抗性倍數(shù)最大的菌株（抗性倍數(shù)42.77倍，＞20，屬高抗菌株）。將該菌株的采集地記錄為濰坊市諸城市郝戈莊鎮(zhèn)，置于4℃冰箱保存，備用。

1.1.2 供試煙草品種

小黃金1025，為煙草黑脛病易感品種，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草研究室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基。

1.1.4 供試藥劑

98%甲霜靈原粉、90%精甲霜靈原油和97%烯酰嗎啉原粉，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司提供；98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威鹽酸鹽原粉，濟(jì)南綠霸農(nóng)藥有限公司提供；混劑原粉（98%氟吡菌胺原粉和92%霜霉威鹽酸鹽原粉以質(zhì)量比1∶10混合），由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室配制。25%甲霜靈可濕性粉劑、50%烯酰嗎啉可濕性粉劑、687.5 g/L氟菌·霜霉威懸浮劑，購(gòu)于德國(guó)拜耳作物科學(xué)公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 殺菌劑對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

采用菌絲生長(zhǎng)速率法。預(yù)試驗(yàn)中根據(jù)Sun等[9]共毒系數(shù)計(jì)算法得出原藥氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽質(zhì)量比為1∶10時(shí)表現(xiàn)出最大增效。結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，用丙酮溶解各原藥，制備1×104mg/L的母液，并確定殺菌劑的有效系列濃度梯度，用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋。在無(wú)菌操作條件下，制備含藥培養(yǎng)基，并接種菌餅至含藥平板中央。以無(wú)菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次，該室內(nèi)毒力試驗(yàn)重復(fù)2次。最后置于（27±1℃）恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，求出藥劑對(duì)煙草黑脛病菌的EC50值等。

1.2.2 氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效試驗(yàn)

將生長(zhǎng)一致的6葉煙苗移栽至花盆中，緩苗1周后分別用甲霜靈375 g a.i./hm2、烯酰嗎啉300 g a.i./hm2及氟菌·霜霉威 386.7 g a.i./hm2、773.4 g a.i./hm2以每株噴灑30 mL藥液對(duì)煙苗進(jìn)行噴淋莖基部處理，以甲霜靈作為對(duì)照藥劑，清水處理作為空白對(duì)照，定義施藥當(dāng)天為施藥0 d。3 d后，將煙草黑脛病菌孢子懸浮液（106cfu/mL）以每株50 mL接種至煙苗莖基部，脫脂棉保濕48 h，置于溫度（27±1℃），相對(duì)濕度95%的溫室中培養(yǎng)。盆栽試驗(yàn)共施藥一次，每個(gè)處理均設(shè)4組重復(fù)，每組重復(fù)20株煙苗。于施藥后28 d記錄煙草黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)。按照下列公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 氟菌·霜霉威對(duì)煙草生長(zhǎng)的影響

于施藥0 d、7 d、14 d、21 d觀察記錄煙株生長(zhǎng)情況，并將施藥28 d煙草株高、莖粗、有效葉片數(shù)及光合速率等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

1.2.4 煙草抗病相關(guān)酶的活性測(cè)定

制備粗酶液參照劉太國(guó)等[10]方法。分別于施藥0 d、7 d、14 d、21 d、28 d取煙草植株由上向下第3～5片展開(kāi)葉，置于-20℃保存，用于測(cè)定多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性和丙二醛（MDA）的含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。PPO活性的測(cè)定參考Aoariciocuesta的方法[11]；POD活性的測(cè)定參考愈創(chuàng)木酚法[12]；SOD活性測(cè)定采用NBT 光化還原法[13]：MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件的最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行單因素方差分析（ANVOA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對(duì)煙草黑脛病菌的室內(nèi)毒力

結(jié)果表明殺菌劑對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出抑制作用（表1）。其中，氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽以質(zhì)量比1∶10的比例混用時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最佳，EC50值為0.06 mg/L。氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑對(duì)病菌菌絲的EC50值分別為0.20 mg/L和3.30 mg/L，毒力低于兩種藥劑混用。此外，精甲霜靈和烯酰嗎啉對(duì)病菌的EC50值為0.70、2.02 mg/L，而甲霜靈對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制效果較差，其EC50值為10.22 mg/L。

表1 6種殺菌劑對(duì)煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 Effect of six fungicides on mycelial growth of Phtophthora nicotianae

2.2 氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的溫室盆栽試驗(yàn)

2.2.1 氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的防治效果

由圖1可知，各殺菌劑對(duì)煙草黑脛病表現(xiàn)出不同的防治效果。其中，氟菌·霜霉威-773.4處理能夠顯著降低煙草黑脛病的發(fā)病率，其防效達(dá)81.50%（圖1a），其次是氟菌·霜霉威-386.7處理，防效為73.67%，氟菌·霜霉威處理的防效均高于烯酰嗎啉（67.83%）和甲霜靈（55.75%）。

圖1 氟菌·霜霉威對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效Fig.1 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride control efficiency of tobacco black shank in greenhouse

2.2.2 氟菌·霜霉威對(duì)煙株生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

盆栽結(jié)果表明，施用殺菌劑處理的煙草植株在株高、莖粗、有效葉片數(shù)、光合速率等指標(biāo)上相比于空白對(duì)照均有不同程度的增加（圖2）。氟菌·霜霉威-773.4處理的煙草植株平均株高、平均莖粗分別是23.87 cm、12.83 cm（圖2a、圖2b），分別比甲霜靈增加了47.89%，18.24%，且該處理的光合速率值（7.94 μmol/m2·s）最高（圖2d），因此有利于提高煙葉光合產(chǎn)物的積累量。氟菌·霜霉威-386.7處理比甲霜靈處理能夠顯著提高株高和莖粗，對(duì)煙株表現(xiàn)出良好的促生效果。烯酰嗎啉處理在株高、光合速率值均低于氟菌·霜霉威-773.4處理。

2.2.3 氟菌·霜霉威對(duì)煙草葉片防御酶活性及MDA含量的影響

由圖3可知，整體來(lái)說(shuō)施用氟菌·霜霉威能增強(qiáng)煙草葉片防御酶活性并降低MDA含量，防御酶的活性隨氟菌·霜霉威施用劑量的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且隨藥劑劑量的上升其影響效果也越顯著。氟菌·霜霉威處理的煙葉PPO活性在施藥7 d 、14 d、21 d和28 d均高于甲霜靈處理（圖3a），且在施藥14 d時(shí)達(dá)到最大值122.42 U/（g·min FW），是空白對(duì)照PPO活性的1.97倍，表明氟菌·霜霉威能夠提高煙株P(guān)PO活性。在施藥14 d內(nèi)，氟菌·霜霉威能夠顯著增強(qiáng)煙株的POD活性（圖3b），其POD活性最大可達(dá)空白對(duì)照的2.07倍，在施藥14 d后各處理的煙草POD活性均呈下降趨勢(shì)，但氟菌·霜霉威處理的POD值仍高于其他處理。接種病原菌后，氟菌·霜霉威在773.4 g a.i./hm2劑量時(shí)，煙草葉片的SOD含量在施藥14 d時(shí)達(dá)到峰值1.95 U/g （圖3c），比對(duì)照高22.73%。與空白對(duì)照相比，氟菌·霜霉威處理能夠顯著降低煙草葉片內(nèi)的MDA的含量，最低可達(dá)1.18 μmol/g。

圖2 氟菌·霜霉威對(duì)煙草株高、莖粗、有效葉片數(shù)、光合速率的影響Fig.2 Effects of the combination of fluopicolide and propamocab hydrochloride on tobacco plant height, stem diameter, effective leaves and photosynthetic number in greenhouse

圖3 不同處理對(duì)煙草葉片防御酶活性及丙二醛含量的影響Fig.3 Dynamic curve of tobacco protective enzyme activities and content of MDA after different fungicides treatment

3 討論與結(jié)論

近年研究發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病病原菌對(duì)常規(guī)殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的抗藥性。Yang等[15]發(fā)現(xiàn)煙草黑脛病菌株已對(duì)甲霜靈產(chǎn)生抗藥性；胡燕等[16]也證明了煙草黑脛病菌對(duì)烯酰嗎啉存在抗性風(fēng)險(xiǎn)。而氟菌·霜霉威作為一種高效、廣譜的復(fù)配殺菌劑，已應(yīng)用于辣椒疫病和馬鈴薯晚疫病等多種病害的防治[17-18]，但尚未登記于煙草黑脛病的防治。本研究結(jié)果表明氟吡菌胺和霜霉威鹽酸鹽兩種單劑均能抑制黑脛病菌絲生長(zhǎng)，且兩種藥劑混用時(shí)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的EC50值僅為0.06 mg/L，顯著優(yōu)于單獨(dú)使用的效果。溫室盆栽試驗(yàn)也表明氟菌·霜霉威在推薦劑量773.4 g a.i./hm2時(shí)能有效防治煙草黑脛病，且防效顯著優(yōu)于甲霜靈和烯酰嗎啉處理。

植株株高、莖粗、有效葉片數(shù)等是評(píng)價(jià)作物生長(zhǎng)情況最基本的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明氟菌·霜霉威處理能夠提高煙草植株的株高、莖粗、有效葉片數(shù)等生長(zhǎng)指標(biāo)，促生效果顯著。劉波微等[19]的研究表明氟菌·霜霉威對(duì)作物具有保產(chǎn)增收的作用。植物抗逆境能力與PPO、POD及SOD等防御酶的活性高低有關(guān)，植物新陳代謝產(chǎn)生的活性氧會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，氟菌·霜霉威處理的煙草葉片PPO、POD和SOD活性均較對(duì)照組有所提高，這也可能是其促進(jìn)煙草生長(zhǎng)的原因。因此，氟菌·霜霉威可作為甲霜靈和烯酰嗎啉的替代藥劑用來(lái)防治煙草黑脛病。