基于藥對探討中藥復(fù)方越鞠丸抗抑郁作用配伍規(guī)律

陶偉偉，肖 東，吳浩然，沈佳麗，黃曉燕，薛文達(dá)，陳 剛

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.中醫(yī)腦病重點實驗室、2. 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

抑郁癥是區(qū)別于簡單情緒障礙的一種持續(xù)時間長且反復(fù)發(fā)作，以情緒低落、悲傷、失望、興趣下降為主要特征的慢性精神疾病。目前被廣泛用于抑郁癥治療的抗抑郁藥，如5-羥色胺重攝取抑制劑(selective serotonin reuptake inhibitor， SSRI)普遍存在起效緩慢、副作用大、易復(fù)發(fā)等缺陷，使得其臨床用藥受到了極大的限制。為了盡可能減少類似抗抑郁藥副作用的發(fā)生，從天然產(chǎn)物的有效成分、藥用植物以及中藥復(fù)方中獲取抗抑郁的有效藥物已逐漸成為關(guān)注的熱點[1]。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可塑性和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)信息的重要調(diào)節(jié)者，研究已經(jīng)證實神經(jīng)營養(yǎng)因子在抑郁及抑郁的治療中發(fā)揮著重要的作用[2]。其中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)廣泛分布于大腦中，特別是海馬齒狀回和皮層中。文獻(xiàn)報道，預(yù)先培養(yǎng)的BDNF能夠明顯抑制由谷氨酸鹽引起的興奮性毒性對海馬神經(jīng)的損害[3]，其受體原肌球蛋白受體激酶B(tropomyosin receptor kinase B，TrkB)能夠引發(fā)多重信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)，這對于細(xì)胞的存活至關(guān)重要[4]。同時近來研究證實，炎癥在抑郁疾病中的重要調(diào)節(jié)作用。并且抑郁也能被許多的炎癥刺激所誘發(fā)，使用抗炎藥物之后，抑郁癥狀能有所改善[5]。因此，我們推測BDNF/TrkB信號通路以及炎癥相關(guān)的調(diào)節(jié)物質(zhì)與抑郁行為相關(guān)。

越鞠丸始載于著名醫(yī)家朱震亨的《丹溪心法》中，其組成為川芎、蒼術(shù)、香附、神曲、梔子各等分，以行氣開郁、疏肝 理脾而治氣郁為主要作用。課題組前期已通過藥理實驗證實越鞠丸對抑郁樣小鼠具有緩解作用，并確認(rèn)其具有潛在的快速抗抑郁效力，且與BDNF、TrkB蛋白的表達(dá)上調(diào)有關(guān)[6]。同時，由于藥對是方劑配伍的一種特殊形式，是方劑的最小配伍單位。因此，本研究以藥對研究為切入點，對中藥復(fù)方越鞠丸抗抑郁作用配伍規(guī)律進(jìn)行研究，并探討其作用機(jī)制，以期為更深入的復(fù)方藥物配伍作用規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實驗動物昆明種♀小鼠264只，體質(zhì)量20～25 g，由常州卡文斯實驗動物公司提供，動物合格證編號：SCXK(蘇)2016-0010。動物房室溫為25℃，晝夜交替12 h，濕度46%，動物正常飲食進(jìn)水。

1.2藥物與試劑越鞠丸全方五味藥依據(jù)藥物處方篩選實驗進(jìn)行等比例配伍，均購于南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂門診。蔗糖購于國藥試劑化學(xué)有限公司(批號：20170406)；鹽酸氯胺酮(ketamine，Ket)由福建古田制藥廠提供(批號：20170301)，并用0.9%的生理鹽水配成30 g·L-1的藥液；RIPA 裂解液(貨號：0013B)購于Beyotime公司；蛋白酶抑制劑Cocktail(貨號：5871S)購于Cell Signaling Technology公司；IL-6[貨號：KGEHC007(H)-1]和TNF-α(貨號：KGEMC123-1)ELISA試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)公司；抗BDNF抗體(sc-546)購自Santa Cruz公司；一抗TrkB(貨號：4603S)、GAPDH(貨號：5174S)、p-NF-κB p65(貨號：3033S)、NF-κB p65(貨號：4764S)、p-IκBα(貨號：5209S)、IκBα(貨號：4812S)均購于Cell Signaling Technology公司。

1.3儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(河南鞏義矛華儀器設(shè)備有限公司)，凝膠成像及分析系統(tǒng)(Tannon公司)，小鼠懸尾強迫游泳實驗視頻分析系統(tǒng)(上海吉量軟件公司)，Nanodrop2000超微量分光光度計(Thermo公司)，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1小鼠急性給藥篩選抗抑郁關(guān)鍵藥對

2.1.1分組與給藥 以越鞠丸原方配比為基礎(chǔ)，將180只小鼠分3批，依次進(jìn)行處方篩選實驗。將篩選組別定為(1)全方；(2)梔子、香附、蒼術(shù)、川芎；(3)梔子、川芎、香附；(4)梔子、香附、蒼術(shù)；(5)梔子、川芎、蒼術(shù)；(6)香附、川芎、蒼術(shù)；(7)梔子、蒼術(shù)；(8)梔子、川芎；(9)蒼術(shù)、川芎；(10)川芎、香附；(11)梔子、香附。越鞠丸及各給藥組醇提物的制備及給藥劑量依據(jù)前期課題組已發(fā)表文獻(xiàn)[7]，各單味藥劑量均為2.7 g·kg-1。因神曲乃入脾胃，助消化之品，考慮其不應(yīng)是主治抑郁癥之藥。選擇小鼠懸尾實驗作為評價方法。設(shè)計如下給藥方案：第1批：取48只小鼠，分為空白對照組、(1)組(13.5 g·kg-1)、(2)組(10.8 g·kg-1)、陽性藥氯胺酮組(Ket 30 mg·kg-1)，每組小鼠12只，灌胃24 h后進(jìn)行小鼠懸尾實驗，實驗結(jié)果作為第2批藥物設(shè)計分組依據(jù)。第2批：取72只小鼠，分為空白對照組、(3)組(8.1 g·kg-1)、(4)組(8.1 g·kg-1)、(5)組(8.1 g·kg-1)、(6)組(8.1 g·kg-1)、陽性藥氯胺酮組(Ket 30 mg·kg-1)，每組小鼠12只，灌胃24 h后進(jìn)行小鼠懸尾實驗，實驗結(jié)果作為第3批藥物設(shè)計分組依據(jù)。第3批：取84只小鼠，分為空白對照組、(7)組(5.4 g·kg-1)、(8)組(5.4 g·kg-1)、(9)組(5.4 g·kg-1)、(10)組(5.4 g·kg-1)、(11)組(5.4 g·kg-1)、陽性藥氯胺酮組(Ket 30 mg·kg-1)，每組小鼠12只。灌胃24 h后進(jìn)行小鼠懸尾實驗。

2.1.2小鼠懸尾實驗 小鼠尾端用膠布固定，放入通用隔音行為箱內(nèi)，并倒掛于懸掛鉤上，保持其尾尖距膠布大約1 cm。小鼠為了擺脫不正常的體位而掙扎活動，活動一段時間即出現(xiàn)間斷性不動，表現(xiàn)出絕望狀態(tài)。記錄小鼠6 min內(nèi)的活動情況，分析后4 min內(nèi)小鼠的不動時間作為絕望時間。

2.2梔子-川芎藥對對慢性應(yīng)激性抑郁癥小鼠行為學(xué)的影響及作用機(jī)制

2.2.1模型建立 60只昆明種小鼠，適應(yīng)3 d，以有效藥對篩選實驗的結(jié)果為基礎(chǔ)，將其隨機(jī)分為對照組(CG)、模型組(MG)、氯胺酮組(Ket 30 mg·kg-1)、慢性不可預(yù)知性刺激+給藥組(5.4 g·kg-1，MH)、慢性不可預(yù)知性刺激+給藥組(2.7 g·kg-1，MM)、慢性不可預(yù)知性刺激+給藥組(1.35 g·kg-1，ML)6組，每組10只。GC組小鼠5只/籠，MG組及給藥組小鼠均單籠飼養(yǎng)。建立慢性不可預(yù)知應(yīng)激性抑郁癥小鼠模型，刺激方式包括禁食禁水各24 h、4℃冰水中游泳5 min、夾尾l min、振蕩5 min(160 Hz)、40℃環(huán)境5 min、晝夜顛倒24 h，共7種刺激，保證小鼠每日作用1種刺激，每種刺激累計出現(xiàn)2～3次，同種刺激隨機(jī)出現(xiàn)，使動物無法預(yù)料何種刺激會發(fā)生。造模3周后，各給藥組單次給藥，CG組和MG組每天給予生理鹽水，于給藥24 h后進(jìn)行糖水消耗、懸尾實驗以及強迫游泳實驗。

2.2.2行為學(xué)測試

2.2.2.1 糖水消耗實驗 依據(jù)文獻(xiàn)[7]，在給藥24 h后進(jìn)行測試，預(yù)先禁食禁水24 h，后將所有小鼠單籠放置，同時給予小鼠1%的蔗糖水溶液與純水各1瓶，實驗前稱取帶水瓶重，放置2 h后，再次稱量帶水瓶重，同時計算蔗糖水和純水消耗量，得出糖水偏好率：糖水偏好率/%=糖水消耗/總液體消耗×100%。

2.2.2.2 小鼠強迫游泳實驗 依據(jù)文獻(xiàn)[6]，在給藥24 h后進(jìn)行實驗，在實驗前預(yù)先調(diào)整實驗室溫度至26℃，將3 L水倒入體積約5 L(直徑18 cm×高25 cm)實驗用玻璃瓶中，水溫調(diào)節(jié)為24～26℃，玻璃燒瓶放置于隔音行為箱中。之后將小鼠依次放入玻璃燒杯內(nèi)，觀察記錄6 min內(nèi)小鼠活動情況，并分析后4 min內(nèi)小鼠游泳的不動時間作為絕望時間。

鑒于此，多稿寫作應(yīng)貫穿于寫作課堂教學(xué)，并配備以及時且積極的反饋方式（即寫作自動批改系統(tǒng)）以及能體現(xiàn)具體性、權(quán)威性和針對性的教師反饋。

2.2.2.3 小鼠懸尾實驗 依據(jù)文獻(xiàn)[6]，在給藥24 h后進(jìn)行實驗，方法同“2.1.2”。

2.2.3細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平的測定 行為學(xué)實驗結(jié)束后，小鼠經(jīng)斷頭取腦組織，于冰上分離海馬組織置于EP管中，-80℃冰箱保存。依據(jù)ELISA試劑盒說明書，檢測海馬組織勻漿液中細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平。

2.2.4Western blot法檢測小鼠海馬組織中相關(guān)蛋白表達(dá) 行為學(xué)實驗結(jié)束之后，小鼠斷頭取腦中海馬體，并提取小鼠海馬蛋白，測定蛋白樣品濃度。依據(jù)BDNF、p-NF-κB p65、NF-κB p65、p-IκBα、IκBα、TrkB蛋白的分子量，選擇適當(dāng)?shù)木郾０纺z(15%、10%、10%、12%、12%、6%的膠)電泳分離蛋白質(zhì)，之后于300 mA，1 h恒流條件下冰浴轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。并將裁剪好的PVDF膜放入BSA封閉液中室溫?fù)u床1 h，然后將膜分別放入預(yù)先加有一抗的抗體盒中，4℃冰箱搖床過夜。次日用TBST緩沖溶液洗膜3次，將PVDF膜分別放入加有對應(yīng)二抗的抗體盒中，搖床上室溫孵育1 h，ECL顯影。采集并分析目的蛋白條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1小鼠急性給藥篩選抗抑郁關(guān)鍵藥對

3.1.1給予藥物24 h后對第1批小鼠懸尾實驗的影響 如Fig 1A所示，給藥24 h后，與空白組相比，(1)、(2)組小鼠及Ket組在懸尾實驗中不動時間明顯降低(P<0.01)。

3.1.2給予藥物24 h后對第2批小鼠懸尾實驗的影響 如Fig 1B所示，給藥24 h后，與空白組相比，(3)、(5)組給藥小鼠在懸尾實驗中不動時間明顯降低(P<0.05)，Ket組不動時間明顯下降(P<0.01)，其余各組與空白組相比差異無顯著性。

3.1.3給予藥物24 h后對第3批小鼠懸尾實驗的影響 如Fig 1C所示，給藥24 h后，與空白組相比，(8)組小鼠在懸尾實驗中不動時間明顯降低(P<0.05)，Ket組不動時間明顯降低(P<0.01)，其余各組與空白組相比差異無顯著性。

3.2梔子-川芎藥對對慢性應(yīng)激性抑郁癥小鼠行為學(xué)的影響及作用機(jī)制

3.2.1動物模型建立情況 造模3周及之后給藥期間，空白對照組小鼠均飲食正常，其余各組均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。Fig 2糖水測試結(jié)果顯示，MG組小鼠糖水消耗量明顯低于CG組(P<0.05)，提示成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生類似焦慮、興趣缺失等抑郁樣行為。而MM、MH組小鼠糖水消耗量明顯高于MG組，提示藥物治療改善了小鼠的抑郁癥狀(P<0.05)，Ket與MG組相比糖水消耗量明顯升高(P<0.01)。

3.2.2給予梔子-川芎24 h后對小鼠強迫游泳實驗的影響 給藥24 h后，F(xiàn)ig 3強迫游泳實驗結(jié)果 顯示，與空白對照CG組相比，MG組小鼠在強迫游泳中不動時間明顯升高(P<0.01)；與MG組相比，給藥MH組小鼠不動時間明顯下降(P<0.05)，Ket組不動時間明顯降低(P<0.01)。

Fig 1 Immobility time of mice in tail suspension

A: Immobility time of the first cohort of mice in tail suspension test at 24 h;B:Immobility time of the second cohort of mice in tail suspension test at 24 h; C: Immobility time of the third cohort of mice in tail suspension test at 24 h. 1:QuanFang;2:XiangFu,ChuanXiong,ZhiZi,CangZhu;3:ChuanXiong,XiangFu,ZhiZi;4:CangZhu,XiangFu,Zhizi;5:CangZhu,ChuanXiong,ZhiZi; 6:ChuanXiong,XiangFu,CangZhu;7:ZhiZi,CangZhu; 8:ZhiZi,ChuanXiong; 9:CangZhu,ChuanXiong; 10:ChuanXiong,XiangFu; 11:ZhiZi,XiangFu.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

3.2.3給予梔子-川芎24 h后對小鼠懸尾實驗的影響 給藥24 h后，F(xiàn)ig 4小鼠懸尾實驗結(jié)果顯示，與空白對照CG組相比，MG組小鼠在懸尾實驗中不動時間明顯升高(P<0.01)；與MG組相比，給藥MM、MH組及Ket組小鼠不動時間明顯下降(P<0.01)。

Fig 2 Effect of CUMS on sucrose preference of

*P<0.05vsCG;#P<0.05,##P<0.01vsMG

Fig 3 Immobility time of mice in forced swimming test

**P<0.01vsCG;#P<0.05,##P<0.01vsMG

Fig 4 Immobility time of mice in tail suspension

**P<0.01vsCG;##P<0.01vsMG

3.3給予梔子-川芎24h后對小鼠海馬中細(xì)胞因子的影響小鼠海馬體中促炎癥因子IL-6和TNF-α的表達(dá)情況反映梔子、川芎的抗炎作用。Fig 5結(jié)果顯示，與空白對照CG組相比，MG組小鼠海馬組織中促炎癥因子IL-6和TNF-α的水平明顯升高(P<0.01)；與MG組相比，給藥ML組小鼠海馬組織中IL-6水平明顯降低(P<0.05)，同樣的，給藥ML、MM、MH組小鼠海馬組織中IL-6和TNF-α的水平明顯降低(P<0.01)。

Fig 5 IL-6 and TNF-α expressions in

**P<0.01vsCG;#P<0.05,##P<0.01vsMG

3.4給予梔子-川芎24h后，小鼠海馬組織中Westernblot檢測結(jié)果

3.4.1小鼠海馬組織中相關(guān)炎癥蛋白表達(dá)情況 為了進(jìn)一步揭示梔子-川芎抗抑郁作用的機(jī)制，對小鼠海馬組織中相關(guān)炎癥蛋白進(jìn)行檢測。Fig 6結(jié)果顯示，與空白對照CG組相比，MG組小鼠海馬組織中p-NF-κB p65、p-IκBα的表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與MG組相比，給藥ML、MM、MH組小鼠海馬組織中p-NF-κB p65的表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)，給藥ML、MH組小鼠海馬組織中p-IκBα的表達(dá)也明顯降低(P<0.05，P<0.01)。

3.4.2小鼠海馬組織中BDNF/TrkB信號通路蛋白表達(dá)情況 Fig 6結(jié)果顯示，與空白對照CG組相比，MG組小鼠海馬組織中BDNF、TrkB的表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與MG組相比，給藥MM、MH組小鼠海馬組織中BDNF的表達(dá)明顯升高(P<0.01)，給藥MH組小鼠海馬組織中TrkB的表達(dá)也明顯升高(P<0.05)。

Fig 6 NF-κB p65, IκBα and BDNF,TrkB expressions

**P<0.01vsCG, #P<0.05vsMG,##P<0.01vsMG

4 討論

本研究以中藥復(fù)方越鞠丸為基礎(chǔ)，通過處方篩選結(jié)合小鼠懸尾行為絕望測試，得到梔子-川芎藥對為其發(fā)揮抗抑郁作用的活性基礎(chǔ)藥對，并通過藥效學(xué)及分子學(xué)實驗，進(jìn)一步對梔子-川芎藥對抗抑郁活性的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步揭示越鞠丸治療抑郁癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及生物學(xué)機(jī)制提供了參考價值。

由于具有預(yù)測的高準(zhǔn)確性，小鼠懸尾實驗普遍被用來作為抑郁評估的行為驗證實驗，廣泛應(yīng)用于抗抑郁藥物的初篩。從以越鞠丸為基礎(chǔ)的逐步處方篩選，到梔子-川芎組合能夠明顯降低小鼠在懸尾實驗中的不動時間，表明通過處方篩選實驗得到的越鞠丸活性基礎(chǔ)藥對能夠?qū)π∈笠钟粜袨槠鸬椒e極作用。

中醫(yī)在治療抑郁癥方面有著多年的實踐基礎(chǔ)，著名醫(yī)家朱丹溪以內(nèi)傷情志致郁為基礎(chǔ)，倡氣、血、濕、痰、熱、食“六郁”之說，并擬越鞠丸以“解諸郁”，成為后世主治郁證的著名方劑[8]。近年來，以越鞠丸為基礎(chǔ)的抗抑郁研究方興未艾，蔣麟等[9]以越鞠丸為基礎(chǔ)，以動物行為絕望實驗為篩選方法，初步證實了梔子-川芎組合的抗抑郁作用；尉小慧等[10]以越鞠丸及各單位藥醇提物對小鼠的抗抑郁作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)越鞠丸全方抗抑郁效果明顯，而川芎、梔子、香附、蒼術(shù)具備一定抗抑郁樣活性趨勢，但只有蒼術(shù)對小鼠懸尾模型有明顯作用，川芎對小鼠強迫游泳模型有明顯作用。提示越鞠丸全方抗抑郁作用與香附、蒼術(shù)、川芎、梔子4味藥有關(guān)，與神曲無關(guān)。此外，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，越鞠丸及單味藥梔子具有潛在的快速抗抑郁作用[7]，并發(fā)現(xiàn)梔子黃素類成分(又稱藏紅花素類)可能是其抗抑郁藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[11]。本研究進(jìn)一步顯示，梔子為主，川穹為輔，兩者相使作用；川穹可以降低梔子的使用劑量，協(xié)同產(chǎn)生抗抑郁作用，這種協(xié)同作用是藥對基本功能的體現(xiàn)。

細(xì)胞因子廣泛參與于機(jī)體的免疫、應(yīng)激以及炎癥的調(diào)節(jié)之中，是內(nèi)分泌系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間重要的信號傳遞因子。其中，轉(zhuǎn)錄因子NF-αB家族通過調(diào)控包括IL-6、TNF-α等多種炎癥基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。越來越多研究表明，細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等生物活性分子含量的改變，以及對先天免疫系統(tǒng)和炎癥進(jìn)程持久性的激動與抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[12]。同時，焦慮、抑郁等負(fù)性情緒可引起下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)的負(fù)反饋失調(diào)，繼而引起免疫功能的異常。有研究證實，抑郁癥的發(fā)病進(jìn)程中存在免疫激活，且抑郁癥患者血中炎癥細(xì)胞因子水平的上升與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。而IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子是HPA軸的有效活化因子[13]。因此，我們在實驗中觀察海馬體中IL-6和TNF-α水平的變化。結(jié)果表明，模型組小鼠海馬體中的兩種促炎癥因子的水平明顯升高，而川芎、梔子組的兩種促炎癥因子水平明顯降低。

BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族主要成員，其通過與TrkB的相互作用維持著神經(jīng)元的存活和功能，其快速表達(dá)增加可改善突觸可塑性，進(jìn)而產(chǎn)生快速抗抑郁作用[14]。激活TrkB/BDNF信號通路受體，可引發(fā)多重信號級聯(lián)反應(yīng)，這對于維持海馬體神經(jīng)元正常的生理功能至關(guān)重要[15]。我們目前的工作揭示，梔子、川芎組合可以明顯恢復(fù)BDNF和TrkB的水平，可能是其改善神經(jīng)可塑性，產(chǎn)生快速抗抑郁作用的機(jī)制之一。

綜上，本研究通過對越鞠丸進(jìn)行處方篩選實驗，得到了其發(fā)揮抗抑郁作用的川芎-梔子基礎(chǔ)藥對組合，并通過藥效學(xué)及分子學(xué)實驗，對其作用的生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了闡釋。為抗抑郁藥理研究的動物模型提供參考，并為今后對越鞠丸的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

(致謝：本實驗于南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)腦病重點實驗室完成，對參與實驗的老師和同學(xué)致以最真摯的謝意！)