一種提高小鼠黑色素瘤在體轉移模型成功率的方法

陳澤慧，章 亮，柴冰陽，張 波

(新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，石河子大學藥學院，新疆 石河子 832002)

黑色素瘤是由異常黑色素細胞過度增生引發(fā)的皮膚腫瘤，容易復發(fā)和轉移，被認為是侵襲性較強的腫瘤，也是皮膚癌的主要死亡原因之一，故黑色素瘤轉移的研究意義重大。體外實驗僅能檢測腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，但機體內的影響無法模擬。為更好地研究腫瘤轉移發(fā)生的機制，穩(wěn)定的在體腫瘤轉移模型是整個研究的基礎。目前，在體轉移模型以尾靜脈注射腫瘤細胞為主[1]，使腫瘤細胞直接通過血液進入全身循環(huán)，此模型可更為準確地評價藥物的抗轉移藥效，成為篩選藥物的首選。

該種方式雖具有實驗周期短、實驗方法簡單等優(yōu)點，但技術操作難度大。由于鼠類尾靜脈較細，尾靜脈注射有一定難度[2]，故成功率難以保證，限制了模型的作用。也有文獻報道，使用兔建立脈絡膜黑色素瘤模型[3]，但涉及精密的眼科手術，對實驗者技術要求較高，術后處理較為繁瑣，因此，本文旨在建立一種操作簡便、成功率較高的模型。有研究表明[4]，原位腫瘤在轉移前，能夠在特定器官組織部位誘導形成一個有利于腫瘤細胞轉移的微環(huán)境，包括免疫抑制、炎性反應、血管生成、通透性增強等特征，抑制機體的免疫將有助于腫瘤細胞的侵襲和轉移。因此，免疫抑制劑的使用可以幫助轉移模型的成功建立。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 C57BL/6小鼠，購于新疆醫(yī)科大學，♀♂各半，6～7周齡，體質量(20～25) g，5只為1籠飼養(yǎng)，自由進水進食，實驗動物房溫度保持在(23±2)℃，濕度40%～ 60%，光照和黑暗時間各12 h。所有動物實驗的管理和動物實驗操作均遵守中華人民共和國衛(wèi)生部動物實驗管理條例和石河子大學實驗動物管理條例。

1.1.2細胞 B16F10細胞(小鼠皮膚黑色素瘤細胞)，購于中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.1.3試劑與儀器 地塞米松磷酸鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司) ；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素6(interleukin 6，IL-6)、白介素10(interleukin 10，IL-10)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)檢測試劑盒(上海西唐生物技術有限公司)。CO2細胞培養(yǎng)箱、多功能全波長酶標儀(美國Thermo公司)；超凈工作臺(上海智誠分析儀器有限公司)；正置熒光顯微鏡Axio Imager A2(德國Zeiss公司)。

1.2方法

1.2.1免疫抑制劑的篩選及相關基因分析 通過The Comparative Toxicogenomics Database (CTD)數(shù)據(jù)庫(http://ctdbase.org/)找到臨床常用的5種免疫抑制劑在動物造模中的靶點，對這些靶點通過String(https://string-db.org/)分析靶點間相互作用，用BioGPS(http://biogps.org/#goto=welcome)分析各靶點在組織的分布情況，數(shù)值大于70者認為在該組織分布較多。進而在Cytoscape (Version: 3.2.1)中做出網(wǎng)絡圖，并利用Cytoscape插件Network Analyzer對網(wǎng)絡進行分析[5]。

1.2.2細胞培養(yǎng) 細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基(青霉素100 kU·L-1、鏈霉素100 mg·L-1)，在37℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d傳代1次。臺盼藍拒染法確定活細胞數(shù)，每次實驗細胞活力保持在95%以上。

1.2.3動物模型的建立 20只C57BL/6小鼠分為4組：空白組、陰性對照組(僅腹腔注射地塞米松)、陽性對照組(僅尾靜脈注射細胞)、造模組(腹腔注射地塞米松及尾靜脈注射細胞)。陰性對照組及造模組小鼠每天腹腔注射地塞米松50 mg·kg-1[6]。d 3取對數(shù)生長期的B16F10細胞，0.25%胰酶消化后，培養(yǎng)基重懸收集細胞，離心，用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，計數(shù)并調整細胞密度為1×109·L-1備用。用75%乙醇消毒小鼠尾部皮膚，取上述B16F10細胞懸液接種于陽性對照組及造模組小鼠尾靜脈，每只接種0.2 mL，即每只小鼠接種2×105個B16F10細胞。接種后，陰性對照組及造模組小鼠繼續(xù)注射地塞米松7 d，每天觀察小鼠體質量及生活習性的改變等情況。

1.2.4血清TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9含量的測定 所有步驟均按照ELISA試劑盒的產品說明書操作。在接種細胞后的第3周，稱取所有小鼠體質量，摘眼球取血于EP管中，室溫靜置30 min后，3 500 r·min-1離心10 min，取血清。每個血清樣品設2個復樣，分別向TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9抗體預包被的96孔板內加入待測樣品和標準品，37℃孵育40 min。洗滌，加第一抗體工作液。洗滌，加酶標抗體工作液37℃孵育10 min。洗滌，加底物工作液37℃暗處孵育15 min后，加終止液結束反應。30 min內用酶標儀在450 nm波長處測量各孔的光密度(optical density, OD)值，根據(jù)標準曲線計算TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9含量。

1.2.5肺部及全身其他臟器的轉移情況 解剖小鼠，觀察肺、淋巴結、腦、肝、腎等臟器有無轉移灶，計算肺部轉移的結節(jié)數(shù)。

1.2.6肺部轉移病灶的病理學檢查 對肺部轉移灶行病理取材，置于4%甲醛固定24 h后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制成石蠟切片，蘇木精伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，鏡下觀察[7]。

2 結果

2.1免疫抑制劑的篩選及相關基因分析選擇臨床常用的5種免疫抑制劑：環(huán)孢素(cyclosporin A, CsA)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)、地塞米松(dexamethasone, DXMS)、雷帕霉素(rapamycin, RAPA)及抗淋巴細胞球蛋白(antilymphocyte globulin, ALG)作為候選。5種藥物在動物造模中分別有39、21、32、16、1個靶點，其中有27個靶點是兩藥及兩藥以上共有靶點。將所有靶點進行組織分布分析后發(fā)現(xiàn)，TIMP-1、STAT3、FOS、AKT1、APP、MAPK3、VIM在肺中占比較多，ABCB4、OVAL、ALB、F7、SOD1在肝臟中占比較多。基于55個節(jié)點(5個免疫抑制劑和50個相關靶點)和111個邊，構建了5種免疫抑制劑的靶點-組織網(wǎng)絡圖(Fig 1)。圖中灰色八邊形節(jié)點為免疫抑制劑，圓形節(jié)點為靶點，其中藍色圓形節(jié)點為肺中靶點，粉色圓形節(jié)點為肝臟中靶點。節(jié)點的大小由其接近中心度決定，接近中心度越大，節(jié)點越大，節(jié)點在網(wǎng)絡中的位置越重要。根據(jù)網(wǎng)絡分析數(shù)據(jù)(Tab 1)，在實驗中選擇地塞米松作為免疫抑制劑。

2.2小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量如Tab 2所示，陰性對照組及陽性對照組小鼠血清中IL-6、IL-10、MMP-9的含量與空白組相比明顯升高(P<0.01)，而造模組小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量均明顯升高(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.3接種后小鼠的一般情況尾靜脈注射過程中，10只小鼠均未見死亡，精神狀態(tài)好，反應靈敏。4組小鼠在造模前體質量無明顯差異，在飼養(yǎng)過程中，陰性對照組體質量下降最多，其余3組無明顯變化(Fig 2)，生活習性無改變。

Tab 1 Target-tissue network analysis data of five immunosuppressants

Fig 1 Target-tissue network map of five immunosuppressants

Fig 2 Body weight changes after inoculation of cells in mice n=5)

2.4小鼠肺部及其他臟器轉移情況空白組及陰性對照組小鼠臟器均無異樣，陽性對照組小鼠僅2只肺部出現(xiàn)1個轉移結節(jié)，結節(jié)較小，顏色較淡。造模組有3只小鼠的肺部出現(xiàn)明顯轉移結節(jié)，最多13個，最少3個，結節(jié)大且顏色黑，并發(fā)現(xiàn)有肝轉移現(xiàn)象(Fig 3、Tab 3)。其他臟器均未發(fā)現(xiàn)轉移灶。

2.5肺轉移灶的病理檢查結果鏡下見C57BL/6小鼠肺轉移模型組織切片，腫瘤組織呈浸潤性生長，部分肺組織結構被破壞，肺泡消失(Fig 4A)。B16F10肺轉移瘤細胞呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，胞核深染，核質比較大，異型性明顯(Fig 4B)。

Fig 3 Metastatic foci of lung and liver after dissection of mice in each group

A: Blank; B:Negative control; C:Positive control; D: Model.

Fig 4 HE staining results of lung metastatic foci (×200)

A: Destruction of lung tissue structure; B: Atypia of tumor cells.

3 討論

轉移是惡性腫瘤的基本生物學特征，也是導致絕大多數(shù)腫瘤患者治療失敗和死亡的主要原因[8]。盡管轉移機制的探討一直是腫瘤學研究的熱點，但是目前人們對于腫瘤轉移的認識還不是十分清楚。因此，建立良好的轉移模型對于腫瘤轉移的研究具有至關重要的意義。該模型應該具有易于建立、可重復性、成瘤時間短、有較長的生存周期等特點。目前，國內外報道的轉移模型多用裸鼠，但裸鼠具有費用高、生存環(huán)境要求高、對藥物耐受性較弱等缺點。因此，本研究旨在建立一種簡便的黑色素瘤轉移模型，選用的是具有正常免疫功能的C57BL/6小鼠，以建立更理想的黑色素瘤轉移模型。為提高轉移成功率，本實驗于接種細胞前后連續(xù)注射地塞米松9 d，抑制小鼠的正常免疫功能，成瘤率及成瘤質量都有明顯提升。

Tab 2 Contents of TNF-α, IL-6, IL-10, VEGF and MMP-9 in serum of each group of

**P<0.01vsblank

Tab 3 Comparison of number ofmetastatic foci in mice and success rate

**P<0.01vspositive control

目前，用來誘導小鼠免疫抑制模型的藥物有氫化可的松、環(huán)磷酰胺、地塞米松等，其中環(huán)磷酰胺是應用最廣泛，也是研究最多的一種建模藥物。但環(huán)磷酰胺屬于烷化劑，可以與DNA形成交聯(lián)，抑制DNA合成，從而抑制細胞增殖[9]，進而影響腫瘤細胞在體內的轉移及生長過程。地塞米松為甾體類抗炎藥，能抑制巨噬細胞、淋巴細胞活性，促進胸腺細胞的凋亡[10]，相較于環(huán)磷酰胺更適宜作為造模藥物。實驗結果顯示，地塞米松明顯增高了造模組小鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-10、VEGF、MMP-9的含量。健康人血清TNF-α水平通常很低，然而，TNF-α在一定范圍內的升高往往與腫瘤轉移、復發(fā)、惡病質相關。有研究檢測前列腺癌患者和正常人血清中TNF-α水平，發(fā)現(xiàn)轉移性前列腺癌患者血清中TNF-α的水平明顯高于其他前列腺癌患者[11]。IL-6能誘導腫瘤細胞發(fā)生上皮間質轉化，使腫瘤細胞的侵襲力和遠處轉移能力增強，增加腫瘤的惡性程度。國內外學者對此作了深入研究，結果發(fā)現(xiàn)，癌癥患者的外周血和細胞中的IL-6水平明顯升高，并與腫瘤的侵襲、轉移、預后以及復發(fā)相關[12]。IL-10為具有很強的免疫抑制活性，在自身免疫疾病及腫瘤免疫治療等方面均有重要作用，尤其是其促進腫瘤生長的作用[13]。原發(fā)腫瘤及轉移灶的生長均需要有新的血管生成，VEGF作為一種內皮細胞的有絲分裂原和促血管生成因子，在轉移瘤的形成中起著十分重要的作用[14]。MMP-9能夠降解細胞外基質，且可以活化VEGF，其在腫瘤細胞生長、侵襲、轉移、血管生成及免疫監(jiān)視中起重要作用[15]。這均與實驗結果相一致，說明地塞米松確實通過抑制小鼠的免疫功能，提升了轉移瘤模型的成功率。

通過網(wǎng)絡藥理學分析可知，地塞米松的作用靶點中有與細胞免疫相關的重要靶點，其中TNF、IFNG為T細胞受體通路靶點，MAPK1、MAPK3、FOS、AKT1為B細胞受體通路靶點。也有腫瘤相關蛋白，如MMP-9、F7、TPR53等，在腫瘤增殖、遷移侵襲過程中具有重要作用。這些靶點也多分布在肺和肝臟，使得實驗結果中不僅有肺轉移灶的產生，也伴有肝轉移現(xiàn)象。然而，實驗過程中陰性對照組小鼠的體質量下降，有可能是因為地塞米松作為長效糖皮質激素類藥物，有一定的肝毒性，改變了肝細胞的微環(huán)境，也導致了肝轉移的發(fā)生。

不論是從實驗結果，還是從理論機制的角度，都表明本實驗小鼠的黑色素瘤轉移模型制備成功。本實驗方法制備的模型成瘤率高、成瘤時間短、生存時間長、制作方法簡單，為之后的藥物研究提供了較好的動物模型。