植物大戰(zhàn)病毒

石楠

在引發(fā)植物疫病的眾多病原體中，病毒可能是最難纏的一類。幸運(yùn)的是，經(jīng)過漫長的協(xié)同進(jìn)化，植物進(jìn)化出了多種對抗病毒的防御機(jī)制?？茖W(xué)家們正在研究這些天然的防御機(jī)制，并試圖結(jié)合新的基因工程技術(shù)，培育出抗病的作物新品種。

2011年，肯尼亞西南部的玉米遭受了一種致命的病害，受感染的植株葉子上出現(xiàn)了蒼白的條紋，然后整株玉米漸漸枯萎死亡。國際應(yīng)用生物科學(xué)中心的科學(xué)家收集了受感染的植物樣本，并將其送到英國的實(shí)驗(yàn)室。隨后研究人員對受感染植物表達(dá)的RNA分子進(jìn)行了測序，測序后發(fā)現(xiàn)，這種疫病是由甘蔗花葉病毒和玉米褪綠斑駁病毒雙重感染造成的。

研究人員對這些病毒并不陌生，因?yàn)樵?0世紀(jì)后半葉，美國堪薩斯州的玉米也曾遭遇了類似的情況。玉米褪綠斑駁病毒會對玉米造成嚴(yán)重?fù)p害，而加上本身對玉米無害的甘蔗花葉病毒之后，它的破壞性更強(qiáng)了。不過，由于更換了抗病性更強(qiáng)的玉米品種，堪薩斯州自1988年以來沒有再發(fā)生過大規(guī)模的致死性玉米病害。然而在2011年，病毒襲擊肯尼亞時，當(dāng)?shù)氐挠衩讌s完全沒有防御能力。在接下來的一年里，這種名為“玉米致死性壞死病”的疫病在肯尼亞7.7萬公頃的玉米地中肆虐，造成的損失約合5200萬美元?，F(xiàn)在，這種疫病已經(jīng)擴(kuò)散到大多數(shù)東非國家，并威脅著數(shù)百萬人的糧食安全。

植物和動物一樣容易受到病毒感染。植物病毒的危險之處在于，它們不像細(xì)菌和其他病原體一樣能用抗生素或殺蟲劑殺死。目前，我們還沒有治愈植物病毒病的有效方法，只能用各種辦法進(jìn)行預(yù)防，而染病的病株只能直接拔掉、銷毀。

當(dāng)然，面對病毒，植物也并不只是被動的受害者，許多植物已經(jīng)進(jìn)化出了對抗病毒感染的免疫機(jī)制?？茖W(xué)家正在研究這些天然免疫機(jī)制，并通過雜交育種或基因編輯等方式增強(qiáng)植物的天然免疫力，從而研發(fā)出抗病的新作物品種。目前，一些基因改造作物已經(jīng)被推廣種植，還有一些正等待監(jiān)管部門的批準(zhǔn)。

植物的天然免疫系統(tǒng)

眾所周知，人體具有復(fù)雜而完善的免疫系統(tǒng)，無時無刻不在抵抗病原體入侵和消滅體內(nèi)的病原體，使我們保持健康。而植物也有一套完善的免疫系統(tǒng)，以對抗各種病蟲害。

植物雖然不像人類一樣有特化的免疫器官和免疫細(xì)胞，但其每一個活細(xì)胞都可以激發(fā)免疫反應(yīng)。一旦病原體（病菌或病毒）進(jìn)入植物細(xì)胞壁范圍內(nèi)，就會觸發(fā)第一道免疫防線。植物細(xì)胞表面的多種“模式識別受體”能夠識別“病原相關(guān)分子”（如細(xì)菌細(xì)胞壁和鞭毛中的某些成分），從而激活多種非特異性免疫反應(yīng)，如增加細(xì)胞內(nèi)抗菌物質(zhì)的含量以殺死病菌，促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而阻止病原體擴(kuò)散等。這些免疫反應(yīng)對抵抗病菌尤其有效，同時對病毒入侵也有一定的防御功能。雖然目前還未發(fā)現(xiàn)專門針對病毒的模式識別受體，但科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞可以識別病毒的核酸。雖然不同生物體內(nèi)核酸的基本結(jié)構(gòu)相同，但真核細(xì)胞內(nèi)的DNA和RNA都具有特殊的生化特征（如RNA的“帽子”結(jié)構(gòu)和DNA的甲基化等），病毒的核酸不具有這些特征，因此會被植物細(xì)胞判定為入侵者，從而激活免疫反應(yīng)。

一些病原體能夠產(chǎn)生某些蛋白質(zhì)干擾植物細(xì)胞中與免疫相關(guān)的激酶，從而突破第一道免疫防線，這類蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為“效應(yīng)因子”。一旦病原體穿過了第一道防線，植物細(xì)胞就會啟動特異性和抵抗力更強(qiáng)的第二道防線。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的“植物抗性蛋白（R蛋白）”識別出效應(yīng)因子時，就會引發(fā)比第一道防線更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)：積累更高濃度的殺菌物質(zhì)；啟動“泛素蛋白酶體通路”，降解病原體的蛋白組分；誘導(dǎo)“超敏反應(yīng)”，殺死感染病原體的細(xì)胞；向其他細(xì)胞傳遞信號，激活植物整體的抗病性。

在與病毒的長期抗?fàn)幹?，植物對?jīng)常感染的一些病毒已經(jīng)產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗性。它們對這些“死敵”有一些更高效、更具針對性的防御對策?？茖W(xué)家對這些特殊的防御對策很感興趣，因?yàn)檫@些防御機(jī)制可能成為培育抗病作物的關(guān)鍵。

防御對策1：RNA沉默

很多植物病毒復(fù)制時就會形成雙鏈RNA，當(dāng)植物細(xì)胞檢測到雙鏈RNA時，它就會啟動RNA沉默（又稱RNA干擾）機(jī)制，阻止病毒基因的表達(dá)。首先，植物體內(nèi)的一種RNA酶——“Dicer蛋白”將病毒烈A轉(zhuǎn)化為“小干擾RNA（siRNA）”。接著，細(xì)胞內(nèi)一些其他的蛋白與siRNA結(jié)合，構(gòu)成一種“RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物（RISC）”。之后，這個蛋白復(fù)合體將根據(jù)siRNA序列來追蹤病毒HA，并將其切割、降解。這是植物保護(hù)自己免受病毒侵害的主要機(jī)制。

在最近20多年，研究人員一直試圖提高植物利用這種機(jī)制來對抗病毒的能力。在20世紀(jì)90年代，美國夏威夷的番木瓜產(chǎn)業(yè)幾乎被番木瓜環(huán)斑病毒所摧毀，這種病毒會使木瓜樹的葉子變黃，導(dǎo)致果樹逐漸枯萎、最終死亡。科學(xué)家將編碼環(huán)斑病毒衣殼蛋白的基因插入細(xì)菌質(zhì)粒中，并用基因槍將質(zhì)粒導(dǎo)入離體培養(yǎng)的木瓜細(xì)胞。質(zhì)粒在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出與病毒RNA，激活了木瓜細(xì)胞的RNA沉默機(jī)制。這一過程就像是注射疫苗，使木瓜細(xì)胞不經(jīng)感染就擁有了對環(huán)斑病毒的抗性。然后，通過組織培養(yǎng)技術(shù)，研究人員將具有抗性的木瓜細(xì)胞培養(yǎng)成植株，這種木瓜的每一個細(xì)胞都出于“備戰(zhàn)狀態(tài)”，一旦環(huán)斑病毒入侵，就立刻使其RNA沉默。這個新品種木瓜被命名為“彩虹”，它于1998年上市，現(xiàn)在已經(jīng)在夏威夷木瓜市場占據(jù)了主導(dǎo)地位。

在過去的幾十年里，植物遺傳學(xué)家也使用了類似的技術(shù)來對抗其他作物病毒。例如，在20世紀(jì)90年代末，科學(xué)家在南瓜中轉(zhuǎn)入黃瓜花葉病毒、西瓜花葉病毒和西葫蘆黃花葉病毒的基因，使其對這些病毒有了抵抗力。這種轉(zhuǎn)基因南瓜已經(jīng)在加拿大和美國獲得批準(zhǔn)。

最近，一些科學(xué)家們正在研究如何利用植物的RNA沉默機(jī)制來提升木薯的抗病力。木薯是一種根莖類作物，在南美洲和非洲的一些地區(qū)，它是數(shù)億人賴以生存的主食。木薯褐條病是由烏干達(dá)木薯褐條病毒（UCBSV）和木薯褐條病毒（CBSV）引起的，木薯對其沒有天然的抵抗力。這種疫病在自20世紀(jì)80年代就出現(xiàn)了，一開始影響范圍不大，到了2004年，病毒蔓延到非洲多個國家，給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)造成巨大的破壞。

2011年，研究人員使用一種細(xì)菌質(zhì)粒，將UCBSV的外殼蛋白基因序列插入到木薯細(xì)胞的基因組中，成功地啟動木薯天然RNA沉默機(jī)制來對抗病毒。在隨后的溫室實(shí)驗(yàn)中，研究人員將染病的木薯枝條嫁接在經(jīng)過基因改造的木薯植株上，這些木薯不負(fù)希望地表現(xiàn)出了百分之百的抗病性。在另一個研究項(xiàng)目中，研究人員在木薯體內(nèi)轉(zhuǎn)入了CBSV衣殼蛋白基因，田間試驗(yàn)結(jié)果顯示，98%的轉(zhuǎn)基因木薯對木薯褐條病毒產(chǎn)生了抗性。

為了生產(chǎn)一種對多種毒株具有抗性的木薯品種，研究人員將來自兩種病毒的全部衣殼蛋白基因序列組合成一個質(zhì)粒，并將其插入到木薯的基因組中。這些轉(zhuǎn)基因木薯在肯尼亞和烏干達(dá)的小規(guī)模田間試驗(yàn)中表現(xiàn)良好，12個月后，25個轉(zhuǎn)基因品種中的16個沒有出現(xiàn)任何癥狀。目前，該項(xiàng)目的田間試驗(yàn)仍在繼續(xù)，研究小組正在與烏干達(dá)和肯尼亞的農(nóng)業(yè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)合作，希望能將這些抗病品種推廣種植。

防御對策2：改變蛋白結(jié)構(gòu)

由于病毒自身攜帶的物質(zhì)有限，它們必須借助宿主細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白才能進(jìn)行復(fù)制。植物保護(hù)自己免受病毒感染的另一種方式是改變體內(nèi)這些“助紂為虐”的蛋白。例如，科學(xué)家在20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)，病毒的“末端結(jié)合蛋白”能與植物中“真核起始因子4E（eIF4E）”家族的蛋白質(zhì)相互作用。真核起始因子在植物細(xì)胞的蛋白合成中起著非常關(guān)鍵的作用，而植物病毒“挾持”了這種蛋白質(zhì)，從而利用植物細(xì)胞本身的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)生產(chǎn)病毒復(fù)所需要的蛋白質(zhì)。

2002年，法國一個研究小組發(fā)現(xiàn)，有幾種辣椒對某些病毒具有天然抗性，其抗性是由eIF4E基因的突變引起的。這種突變使一種起始因子的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而阻礙了它與病毒蛋白的結(jié)合。與此同時，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一種擬南芥突變株，其體內(nèi)一種eIF4E的基因被關(guān)閉，這一突變不會影響植物的正常生長，但阻礙了病毒的復(fù)制。最近，日本科學(xué)家在擬南芥體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種變異的蛋白質(zhì)，它能抑制“車前草亞洲花葉病毒”的移動蛋白，使其不能在植物細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，從而避免整株植物受感染。

長期以來，植物育種專家一直在利用這種自然產(chǎn)生的遺傳抗性，選擇性地將栽培作物與抗病的野生品種雜交，以生產(chǎn)抗病力更強(qiáng)的作物。例如，在20世紀(jì)80年代，科學(xué)家們將木薯與其野生“近親”、抗木薯花葉病的樹木薯雜交，獲得了抗病性強(qiáng)的木薯品種。然而，這種傳統(tǒng)的育種方法可能需要數(shù)年到數(shù)十年的時間，如果針對每一種新的病毒都必須引入新的抗性基因，這種方法就更麻煩了。最近，科學(xué)家們利用基因工程技術(shù)，能夠更迅速、更精確地武裝農(nóng)作物。

2017年，科學(xué)家經(jīng)過篩選，發(fā)現(xiàn)了木薯中的兩種起始因子蛋白會與CBSV和UCBSV的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。然后，研究人員利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)編輯了相關(guān)基因的序列，以阻止這兩種蛋白的表達(dá)。在溫室試驗(yàn)中，這種經(jīng)過基因編輯的木薯顯示出較強(qiáng)的抗病性，但它對木薯褐條病不能完全免疫。這表明病毒也可能與其他未經(jīng)編輯的起始因子相互作用。研究人員希望對木薯基因組繼續(xù)作進(jìn)一步調(diào)整，以設(shè)計(jì)出一種完全抗病的品種。

隨著對植物天然防御機(jī)制的進(jìn)一步了解，隨著基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展，科學(xué)家能夠更準(zhǔn)確、高效地設(shè)計(jì)出抗病的作物品種。但這卻是一場艱苦的戰(zhàn)斗。因?yàn)椴《驹诓粩嘧儺?、進(jìn)化，其速度比植物計(jì)劃的速度快很多，而每一種病毒都會對這種植物的防御機(jī)制產(chǎn)生抗性，這只是時間問題。例如，許多病毒能制造一種蛋白質(zhì)，它可以吸收siRNA，從而阻止RNA沉默；而一些病毒改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使它們能夠與植物體內(nèi)變異的起始因子蛋白結(jié)合。

雖然基因編輯有助于開發(fā)抗病性更強(qiáng)的作物，但這種方法在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用仍處于初級階段。每一個經(jīng)過基因改造的新品種都需要進(jìn)行長期的試驗(yàn)，確保其安全性之后才能被推廣種植。目前，面對植物病毒病，嚴(yán)格的檢疫仍然是關(guān)鍵。快速識別新的病毒威脅，在疫病大規(guī)模擴(kuò)散前遏制疫情，才能有效避免嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，這對很多作物品種換代慢，防疫投入不足的發(fā)展中國家尤為重要。

2011年，國際應(yīng)用生物科學(xué)中心（CABI）啟動了一個名為“植物智慧”的項(xiàng)目，與非洲農(nóng)民合作，幫助診斷和治療作物的疾病。項(xiàng)目的主要創(chuàng)新之一是“植物診所”，當(dāng)?shù)剞r(nóng)民可以與訓(xùn)練有素的植物衛(wèi)生專家會面，識別自家田地里害蟲和病原體。通過與農(nóng)民會談，科學(xué)家能第一時間發(fā)現(xiàn)各地出現(xiàn)的新的疫病，植物診所在疫病的早期檢測中起到了重要作用。一些新技術(shù)也在其中發(fā)揮了重要作用。例如，科學(xué)家正在使用便攜式DNA測序儀，幫助發(fā)展中國家的農(nóng)民識別新的病毒，使他們能夠迅速采取行動，減少疫病傳播。

盡管在對抗植物病毒方面仍存在許多挑戰(zhàn)，但科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步也讓我們有了更多的對策。在與植物病毒曠日持久的戰(zhàn)爭中，目前我們正占據(jù)著上風(fēng)。

植物細(xì)胞中的“病毒工廠”

在19世紀(jì)50年代后期，一種毀滅性的疫病開始在荷蘭的煙草種植園中蔓延，患病煙草的葉片先是出現(xiàn)花斑，然后逐漸萎縮、壞死，因此這種疫病被稱為“煙草花葉病”。當(dāng)時的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，把受感染的煙草的汁液注入健康的植物中，健康植株也會患病。他們因此認(rèn)為。這種疫病是由細(xì)菌引起的。然而，后來又有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，將患病煙草的汁液經(jīng)過陶瓷制成的細(xì)菌過濾器（陶瓷的微孔能比細(xì)菌的尺寸小，因此能過濾掉細(xì)菌）過濾之后，仍然具有傳染花葉病的能力，這表明傳播這種疫病的病原體并非細(xì)菌。1898年，荷蘭微生物學(xué)家貝杰林克創(chuàng)造了“病毒”一詞，用來描述這種神秘“傳染因子”。

20世紀(jì)上半葉，科學(xué)家搞清了病毒的基本構(gòu)造，但對它們致病的機(jī)理并不了解。20世紀(jì)50年代，科學(xué)家們開始使用電子顯微鏡來觀。察病毒和植物細(xì)胞的相互作用。揭示了在受感染細(xì)胞中發(fā)生的巨大變化。研究人員發(fā)現(xiàn)，被感染的細(xì)胞中有很多囊泡狀的結(jié)構(gòu)，像是某種新的細(xì)胞器。

30多年后，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，這些直徑從50到350納米不等的奇怪囊泡是病毒感染的主要來源，它被稱為“病毒原質(zhì)”或“病毒工廠”。在這些囊泡中。病毒利用植物細(xì)胞中的原材料進(jìn)行瘋狂復(fù)制，增殖的病毒又會感染新的宿主。這些“工廠”的生產(chǎn)效率非常高，例如，番茄叢矮病毒可以在24小時內(nèi)產(chǎn)生近100萬個后代。這是一個令人難以置信的強(qiáng)大過程。這些“工廠”也可以保護(hù)其中的病毒，使它們避開植物免疫系統(tǒng)的識別。

新的病毒（或病毒基因組）會通過植物細(xì)胞之間的胞間連絲進(jìn)入鄰近的細(xì)胞中。但這些通道通常只允許小分子的轉(zhuǎn)運(yùn)，蛋白質(zhì)和核酸無法通過。于是，這些病毒耍了一點(diǎn)小花招。它們釋放出一種“移動蛋白”。讓通道擴(kuò)大，這樣它們就可以順利通過了。一些病毒會進(jìn)入植物的韌皮部，某些昆蟲（如蚜蟲）在吸食樹汁時可能將病毒一并吸走，并帶到其他的植株中去，造成大片作物接連感染。

自噬——“吃掉”病毒

最近的一些研究發(fā)現(xiàn)，植物可以通過自噬作用來清除體內(nèi)的病毒。細(xì)胞自噬是依賴溶酶體途徑對胞質(zhì)蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解的一種過程，其主要功能是清除受損的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和不再需要的生物大分子，并將這些成分降解和再利用。

清華大學(xué)的學(xué)者發(fā)現(xiàn)，植物的一種自噬蛋白能與雙子病毒（一類具有環(huán)狀單鏈DNA的植物病毒）的一個關(guān)鍵基因結(jié)合，并將其運(yùn)送到自噬體中進(jìn)行降解。研究發(fā)現(xiàn)，在某些病毒中，這一基因發(fā)生了突變，不能被植物的自噬蛋白識別，這使它具有更強(qiáng)的感染性。另一方面，研究人員促進(jìn)了“本氏煙”（一種煙草屬植物，研究植物與病毒互作的模式生物）細(xì)胞的自噬作用，發(fā)現(xiàn)其對幾種雙子病毒產(chǎn)生了更強(qiáng)的抗性。

最近，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)和加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn)，植物中另一種自噬蛋白能介導(dǎo)RNA聚合酶的靶向自噬，從而抑制RNA病毒的復(fù)制。

掌握了植物細(xì)胞自噬的抗病毒機(jī)制，科學(xué)家們希望能將其應(yīng)用到作物育種中來，如選擇自噬反應(yīng)更快的品種，以獲得高抗病性的作物。