三黃瀉心湯體外抑制耐藥金黃色葡萄球菌活性測(cè)定

王鈺雄，劉偉偉，李雪萍，何熙果，王艷秋

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)2013級(jí)本科生，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)2015級(jí)本科生，四川 成都 611137）

“三黃瀉心湯”亦稱“瀉心湯”，是張仲景的經(jīng)典方劑，由黃連、大黃、黃芩組成，有瀉火解毒、清熱燥濕、除痞止血之功效，是中醫(yī)臨床治療心胃火邪內(nèi)熾證的常用方劑。本研究對(duì)三黃瀉心湯的傳統(tǒng)湯劑進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌和普通耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用進(jìn)行觀察，探討三黃瀉心湯的抑菌作用。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與藥物

實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫培養(yǎng)箱，凈化工作臺(tái)，DHG--9125A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，壓力蒸汽滅菌器，電子天平等。

藥物：大黃、黃連、黃芩（成都新荷花藥業(yè)有限公司），營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供），普通耐藥金黃色葡萄球菌（成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供），標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌（中科院生物研究所提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 三黃瀉心湯的制備

取中藥飲片大黃10g，黃連5g，黃芩5g（質(zhì)量比為2∶1∶1）混合，加300mL純化水浸泡30 min，煎煮60 min，后濃縮為200mL，制成含生藥1g/mL藥液，即每1mL濃縮液相當(dāng)于原生藥1g，過濾后放入燒杯內(nèi)密封，置4℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)時(shí)，稀釋至相應(yīng)濃度。

2.2 0.5麥?zhǔn)纤幟艟旱闹苽?/p>

0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽?.2mL0.25%BaCl2、9.8mL1%H2SO4，約1×108/mL。1麥?zhǔn)媳葷峁埽?.4mL0.25%BaCl2、9.6mL1%H2SO4，約3×108/mL。

普通耐藥菌菌液。將純化的普通耐藥菌接種于普通瓊脂平板上，做好標(biāo)記，35℃培養(yǎng)24 h，無菌操作挑取新鮮培養(yǎng)的菌落，加入3mL的無菌生理鹽水試管中，混勻后與0.5麥?zhǔn)虾?麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管比較，逐步調(diào)整菌液濃度至0.5麥?zhǔn)献笥?，作為供試菌液?/p>

標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌菌液。按說明書方法，在超凈臺(tái)復(fù)蘇細(xì)菌。用接種環(huán)蘸取菌液，直接涂布到瓊脂平板上，做好標(biāo)記35℃培養(yǎng)24h。按上述方法制作0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)耐藥菌，作為供試菌液。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定及結(jié)果

二倍試管稀釋法。取無菌試管10只，編號(hào)A1-A10，于A2-A10中加入10mL無菌水，取中藥原液20mL，于A1中加入10mL。A2中加入10mL，混合后取出10mL，加入到A3中，以此類推至A9，混合后取出10mL，棄之。A10中只有無菌水。這樣就形成了從A1-A9濃度依次為10%（1∶10）、5%（1∶20）、2.5%（1∶40）、1.25%（1∶80）、0.625%（1∶160）、0.3125%（1∶320）、0.15625%（1∶640）、0.078125%（1∶1280）、0.0390625%（1∶2560）。

制備含藥瓊脂培養(yǎng)基。瓊脂培養(yǎng)基配方為：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化鈉5.0g，瓊脂20g，溶解于1000mL純水中，pH＝7.3±0.1。

取上述540mL培養(yǎng)基，分裝于10個(gè)燒瓶，每個(gè)54mL，編號(hào)B1-B10，取上述稀釋中藥液，按6mLA1加入B1，6mLA2加入B2，以此類推，逐次將藥液與培養(yǎng)基混勻，混合后于121℃高壓滅菌15min，冷至50℃時(shí)，將B1中培養(yǎng)基在超凈臺(tái)上分別傾注6個(gè)平皿，每個(gè)10mL含藥培養(yǎng)基，重新編號(hào)。濃度由高到低依次為A1、A2、A3、A4、A5、A6……J1、J2、J3、J4、J5、J6共60個(gè)培養(yǎng)皿。放4℃?zhèn)溆谩＿@樣每個(gè)培養(yǎng)基的含藥濃度為對(duì)應(yīng)2.3.1中藥液濃度的1/10。另制備若干普通瓊脂培養(yǎng)基備用［1］。

接種。在超凈臺(tái)內(nèi)，用接種環(huán)蘸取上述0.5麥?zhǔn)掀胀退幘海诠鼙跀D壓去多余的菌液，均勻地涂布在A-J組的平板上，另用燒灼滅菌的接種環(huán)在未編號(hào)的空白瓊脂培養(yǎng)基上，以接種的操作劃線。將上述61個(gè)平板置于35℃溫箱，培養(yǎng)24h。24h后觀察并記錄各平板結(jié)果，以無菌生長(zhǎng)的含藥平板的藥濃度為普通耐藥菌MIC。同樣的操作，確定標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌MIC。

結(jié)果顯示，三黃瀉心湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌、普通耐藥金黃色葡萄球菌的MIC分別為2.5mg/mL、0.3125mg/mL，空白培養(yǎng)基未見細(xì)菌生長(zhǎng)。結(jié)果見表1-2。

表1 不同濃度三黃瀉心湯對(duì)普通耐藥金黃色葡萄球菌抑菌作用測(cè)定結(jié)果 （mg/mL）

表2 不同濃度三黃瀉心湯對(duì)標(biāo)準(zhǔn)耐藥金黃色葡萄球菌抑菌作用測(cè)定結(jié)果 （mg/mL）

3 討 論

三黃瀉心湯中大黃、黃連和黃芩三味中藥，其各成分均有一定抗菌作用［2］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示三黃瀉心湯具有抑制MRSA的作用，對(duì)臨床分離的普通耐藥性金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)MRSA。

現(xiàn)代研究證實(shí)，MRSA細(xì)菌耐藥的原因與β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和青霉素結(jié)合蛋白2a（PBP2a）的產(chǎn)生有關(guān)，PBP2a是一種β-內(nèi)酰胺類抗生素低親和性蛋白，在MRSA細(xì)菌耐藥中起著主要的作用［3］。FtsZ蛋白是最早出現(xiàn)的細(xì)菌分裂蛋白，在細(xì)胞分裂中起主要作用，介導(dǎo)PBP2在細(xì)胞分裂過程中插入到細(xì)胞膜中，由于PBP2是MRSA抗β內(nèi)酰胺類抗菌素所需要的，因此破壞其活性可重新使MRSA對(duì)β內(nèi)酰胺類變得敏感。抑制FtsZ蛋白還能抑制MRSA的生長(zhǎng)和生存能力。因此我們推測(cè)FtsZ蛋白有可能是三黃瀉心湯治療MRSA的作用靶點(diǎn)之一。

本研究表明，三黃瀉心湯對(duì)普通耐藥菌和標(biāo)準(zhǔn)耐藥菌均有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)前者的活性是后者的8倍，由此證明三黃瀉心湯對(duì)耐藥菌有較強(qiáng)的抑制作用，但三黃瀉心湯對(duì)于FtsZ的作用影響有待進(jìn)一步研究。