復(fù)方丹參滴丸處理對大鼠移植心臟心肌細胞保護作用及細胞凋亡線粒體途徑的影響

劉尊濤，胡定輝，杜 琎，李 航，李鴻雁

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胸心外科，江蘇 南京 210028；2.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院胸心外科，江蘇 南京 210009）

為了探究復(fù)方丹參滴丸處理對大鼠移植心臟心肌細胞保護作用及細胞凋亡線粒體途徑，研究利用大鼠移植心臟缺血再灌注損傷模型，分析復(fù)方丹參滴丸處理對大鼠移植心臟心肌細胞產(chǎn)生的影響，為臨床應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 實驗材料及試劑

SD大鼠，復(fù)方丹參滴丸，兔抗鼠Bcl-2及Bax多克隆抗體、HRP-羊抗鼠二抗、TUNEL試劑盒，Powerlab多導(dǎo)生理記錄儀等。

2 手術(shù)方法

受體的制備。受體鼠術(shù)前禁食6～8 h。用1%戊巴比妥鈉按50mg/kg劑量腹腔注射麻醉，麻醉后固定四肢。腹部脫毛，碘伏消毒，腹部正中切口進腹，顯露腹主動脈和下腔靜脈備用。

供心摘取。同受體麻醉，固定，術(shù)區(qū)備皮，消毒。腹部正中切口進腹，暴露下腔靜脈經(jīng)其注入125u/mL肝素鹽水2mL并剪斷放血，迅速打開胸腔，游離修剪供心，置入冰水混合物中保存。

供心移植。暴露吻合口部位，采用Ono氏術(shù)，供心升主動脈和主肺動脈分別與受體的腹主動脈和下腔靜脈作端側(cè)吻合。供體心臟恢復(fù)血供之后大多先出現(xiàn)纖顫，用40℃左右生理鹽水澆淋心臟使之快速復(fù)溫，心臟復(fù)跳。觀察無出血后，縫閉腹腔，燈照保溫1 h。

術(shù)后處理與觀察。手術(shù)后根據(jù)術(shù)中出血情況補入生理鹽水5～6mL，保溫。

3 實驗設(shè)計

SD大鼠48只，隨機分為4組，每組6例心臟移植（其中供體6只，受體6只），分組如下：①單純移植組，術(shù)前未用任何藥物。②缺血后處理組：術(shù)前未用任何藥物，移植術(shù)畢，供心升主動脈完全開放前間斷開放15s阻斷15s，共3次。③復(fù)方丹參滴丸處理組，供體每日灌胃1次，連續(xù)7天，復(fù)方丹參滴丸溶于5mL生理鹽水中。④模型對照組，供體于相應(yīng)時間內(nèi)等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)7天。實驗結(jié)束后24h，分別處死各組動物，立即取出供心用冰生理鹽水洗滌后置于液氮中保存。實驗結(jié)束后利用Western blot對p53，Bcl-2及Bax蛋白水平進行分析，再利用TUNEL染色法及Western blot，對心肌細胞凋亡情況進行分析。

用SPSS18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié) 果

相較于其他3組，復(fù)方丹參滴丸組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)及Bax、P53蛋白陽性染色指數(shù)、Bcl-2的蛋白陽性表達較穩(wěn)定，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）單純移植組、缺血后處理組以及模型對照組3組間各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 4組心肌細胞凋亡指數(shù)及Bax、Bcl-2、P53蛋白陽性表達比較

5 討 論

缺血再灌注損傷時心肌細胞由于缺血、缺氧等因素可導(dǎo)致出現(xiàn)細胞凋亡，這個過程是在凋亡基因調(diào)控下展開的。Bcl-2/Bax比值在對細胞凋亡過程介導(dǎo)中有著重要作用［1］。Bcl-2有抑制細胞凋亡的重要作用，而Bax則可以直接促進細胞凋亡，Bcl-2及Bax都是正負調(diào)控的凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值影響著細胞區(qū)域凋亡還是存活問題［2］。近年來，有研究顯示，缺血再灌注損傷時Bcl-2/Bax比值會出現(xiàn)明顯下降。大鼠移植心臟缺血再灌注損傷后心肌細胞Bcl-2/Bax也出現(xiàn)顯著下降，提示移植心臟缺血再灌注損傷后心肌細胞出現(xiàn)凋亡。p53是介導(dǎo)細胞凋亡的一種調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)細胞受損傷及輻射等影響時，p53表達上調(diào)且直接介導(dǎo)細胞凋亡［3］。Bax與Bcl2同為p53調(diào)控的線粒體凋亡途徑Bcl2蛋白家族成員，單純移植組和模型對照組p53蛋白水平升高，說明p53活化介導(dǎo)的線粒體凋亡通路Bax蛋白高表達可能是心肌缺血再灌注損傷后心肌細胞凋亡的原因之一。復(fù)方丹參滴丸可能通過下調(diào)p53蛋白水平抑制細胞凋亡信號通路，從而阻斷心肌細胞凋亡蛋白，降低心肌細胞凋亡，對心臟功能進行保護［4］。