高效液相色譜分析不同理化因素對血紅素輔基穩(wěn)定性的影響

劉 越， 孫 沖， 李鵬鵬， 張新笑， 徐為民

(1.南京農(nóng)業(yè)大學，江蘇南京 2100952； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014)

肉色是肉品的一個外在指標，肉品的色澤可以直觀反映其新鮮程度，是其能否被消費者接受的關鍵因素[1]。新鮮牛肉的顏色為櫻桃紅色，在空氣中放置后會很快變?yōu)轷r紅色，之后又轉變?yōu)楹稚玔2-3]，即使在冷藏期間，顏色也會隨時間發(fā)生改變[4]。在肉品貯藏和加工過程中，肉色的保持并非易事，需要探究肉品色澤變化的機制，采取合適的保護措施以盡可能地減少肉色損失。肉品的色澤主要由肌紅蛋白決定，肌紅蛋白由珠蛋白和1個血紅素輔基構成，而肌紅蛋白的顏色主要受血紅素輔基結構和氧化狀態(tài)的影響，如果血紅素輔基結構發(fā)生改變，肌紅蛋白的結構和功能也很可能發(fā)生變化。血紅素輔基是由(亞)鐵離子和原卟啉形成的復合物[5]，其中心的鐵原子與卟啉環(huán)形成4個配位鍵，鐵原子的第5配位位置由組氨酸的咪唑氮原子在軸向結合形成配位鍵，第6配位位置可同氧或其他小分子結合，鐵原子電子狀態(tài)的變化會直接影響整個血紅素的電子狀態(tài)，從而表現(xiàn)出不同的吸收光譜[6-7]。

在動物從被屠宰到肉品銷售過程中，肉品貯藏和運輸期間的時間因素、加工過程中溫度和pH值的變化，以及常見的食品添加劑氯化鈉、消毒劑次氯酸鈉[8]等理化因素都可能對肉品的色澤產(chǎn)生一定的影響。以往有研究表明，在時間、pH值、溫度等理化因素下，肉品的肉色表現(xiàn)出一定的變化規(guī)律[9-10]，但是對于血紅素輔基穩(wěn)定性的研究很少。本研究擬更深入地分析肌紅蛋白上的關鍵結構血紅素輔基，通過試驗探究在不同理化因素下血紅素輔基穩(wěn)定性的變化規(guī)律。以往研究肌紅蛋白及血紅素輔基大多采用紫外光譜法[11]，該方法在抗干擾、定量的準確程度等方面存在一定的缺陷。本研究采用反相高效液相色譜法探究不同理化因素對血紅素輔基穩(wěn)定性的影響，以更加精確地分析血紅素輔基受不同理化因素的影響程度，從而深入地了解影響血紅素輔基結構穩(wěn)定性的關鍵因素，為將來控制肌紅蛋白血紅素輔基結構的變化、穩(wěn)定肉色提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新鮮牛肉，購自南京市玄武區(qū)下馬坊蘇果超市；肌紅蛋白標品為馬骨骼肌紅蛋白(美國Sigma公司)。其他試劑均為分析純，所有溶液均用超純水配制。

M124A萬分之一分析天平(意大利BEL公司)；WH2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；FE20實驗室pH計[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；HH8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；SPX250C恒溫培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司)；UPC10AKTA蛋白純化儀(美國GE Healthcare)；Sephadex G200凝膠柱(美國GE Healthcare)；Waterse2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；AgilentZX26液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(美國Agilent Technologie公司)。

1.2 試驗方法

牛肉肌紅蛋白的提取參考Thiansilakul的方法并加以修改[12]。

1.2.1 肌紅蛋白粗提物的提取 取100 g肉糜與300 mL冷的萃取介質(zhì)[50 mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，pH值8.0]混勻，10 000 r/min 勻漿1 min，然后于9 600g離心15 min，吸出上清液于飽和度為75%的硫酸銨中鹽析1 h，將上清液于 10 000 r/min 離心30 min，取粉紅色的上清液，將鹽析的蛋白質(zhì)上清液置于透析袋中(截留分子量為7 000 u)，通過10倍體積的預冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值8.0)透析除去硫酸銨，將透析袋置于冷凍恒溫搖床中，轉速為 100 r/min，透析液換10次，即得到肌紅蛋白的粗提物，所有提取過程在4 ℃條件下進行。

1.2.2 蛋白層析分離純化 肌紅蛋白純化用的層析柱為Sephadex G200凝膠柱，進樣前先用冷的Tris-HCl緩沖液(50 mmoL，pH值為8.0)平衡凝膠柱，將透析后的肌紅蛋白經(jīng)0.2 μm濾孔過濾后進樣，每次上樣1 mL，流速為 1 mL/min，紫外檢測波長為280 nm，收集出峰位置的溶液于10 mL EP(Eppendorf)管中，4 ℃保存。

1.2.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE)分析 SDS-PAGE電泳樣品前處理：在0.2 mL除鹽后的純化蛋白液中加入0.4 mL上樣緩沖液后于95 ℃處理 5 min。SDS-PAGE電泳采用15%分離膠，5%濃縮膠，每孔等體積上樣20 μL，電泳電壓為160 V，持續(xù)時間為50～60 min，取出凝膠塊，用考馬斯亮藍染色液染色10 min后取出，加入適量的脫色液，放在搖床上使脫色更加均勻迅速，1 h后更換脫色液，直至脫色完成，取出凝膠塊，用凝膠成像儀進行成像分析。

1.3 液相收集與質(zhì)譜分析

分別收集反相高效液相色譜出峰位置的液體，隨后利用固相萃取(solid phase extraction，簡稱SPE)柱對收集液進行凈化濃縮，用氮氣吹干至乙腈完全去除，用少量雙蒸水溶解管壁內(nèi)的溶質(zhì)，最后用液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜進行分析。

質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；離子化條件：氣溫與流速分別為300 ℃、3 μL/min，針泵直徑為 2.3 mm，毛細管電壓為5.5 kV，采集時間為0.5 s，霧化器壓力(GS1)、輔助器壓力(GS2)均為206.842 7 kPa。數(shù)據(jù)通過分析軟件PeakView進行定性分析。

1.4 液相色譜分析

1.4.1 色譜條件 色譜柱：C18反相色譜柱；流動相：A為 0.1% 三氟乙酸(TFA)溶液，B為0.1% TFA-乙腈；流速為 1 mL/min；柱溫為25 ℃；波長為210～410 nm。洗脫梯度：0～10 min，5%～60% B；10～20 min，60% B；20～25 min，60%～5% B。

1.4.2 靜置時間對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中，放置0、1、3、5、7 d后分別進行液相分析。

1.4.3 溫度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，置于4、20、30、40、50 ℃恒溫水浴鍋中水浴60 min后分別進行液相分析。

1.4.4 pH值對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，緩沖液pH值設為3、5、7、9、11，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中60 min后分別進行液相分析。

1.4.5 氯化鈉濃度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，加入質(zhì)量分數(shù)為 1%～5%的氯化鈉，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中60 min后分別進行液相分析。

1.4.6 次氯酸鈉對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 制備質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的肌紅蛋白溶液，加入1%次氯酸鈉(將pH值調(diào)節(jié)至12)，空白處理用雙蒸水代替，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中1～6 h后分別進行液相分析。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析

已知肌紅蛋白的相對分子質(zhì)量約為16 ku，從圖1中可以看出，條帶4、條帶2(圈中所示的帶)處于同一位置，且泳道4中可見的條帶只有1個(圈中所示的帶)，說明條帶4對應的收集液為肌紅蛋白，且較純；與泳道4相比，泳道3中含有多條帶，說明肌紅蛋白粗提物經(jīng)過蛋白層析儀處理后達到了較好的純化效果。

2.2 液相收集與電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)分析

由高效液相色譜圖可見，在280 nm紫外波長下，肌紅蛋白在10.9、13.3 min處有較明顯的吸收峰；當波長為400 nm時，肌紅蛋白只在13.3 min處有明顯的吸收峰(圖2)。

由圖3可以看出，肌紅蛋白標品質(zhì)譜圖的主要峰在 16 952.0 u 處，另外1個較明顯的峰在17 567.1 u處；由圖4可以看出，肌紅蛋白液相色譜在10.9 min處收集液的質(zhì)譜圖的主要峰在 17 567.7 u 處，另外1個較明顯的峰在16 952.0 u 處；由圖5可以看出，肌紅蛋白液相色譜在13.3 min 處收集液的質(zhì)譜圖的主要峰在 764.5、765.5 u處。

綜上分析可知，圖3、圖4這2個質(zhì)譜圖的2個主要峰相似，相關研究表明，肌紅蛋白相對分子量在16 700.0 u左右，可以推斷16 952.0、17 567.1 u處的峰代表的是肌紅蛋白、珠蛋白。圖5中主要峰的相對分子量為764.5 u，推測該峰代表的是血紅素輔基，將該樣品通過紫外波長掃描可以發(fā)現(xiàn)，它在400 nm處有明顯的特征峰，可進一步得出肌紅蛋白液相色譜在13.3 min處收集的樣品是血紅素輔基。因此，在液相試驗考察各因素對血紅素輔基穩(wěn)定性影響的研究中，選擇波長為400 nm、時間為13.3 min處的吸收峰作為參照。

2.3 液相分析

2.3.1 靜置時間對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 由圖6可以看出，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積隨著靜置時間的增加逐漸降低，在1～7 d間有顯著差異(P<0.05)，在1、3、5、7 d時，分別比0 d時降低了1.07%、8.83%、16.05%、22.29%，說明隨著時間的延長，血紅素輔基損失逐漸增加，并且在1 d后，其損失速率加快。推測其原因，可能由于肌紅蛋白在空氣中易發(fā)生自氧化，在自氧化過程中產(chǎn)生的自由基會反作用于肌紅蛋白，從而破壞肌紅蛋白上的血紅素輔基，造成血紅素輔基的損失[13]。有研究表明，隨著時間的延長，從肌紅蛋白上脫落的血紅素輔基會進一步發(fā)生裂解，鐵離子從卟啉環(huán)中游離出來，留下空位的卟啉環(huán)，造成其吸收峰強度的降低[14-15]。

2.3.2 溫度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 圖7結果顯示，隨著溫度的升高，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積無明顯差異，說明在4～50 ℃、60 min內(nèi)，血紅素輔基的穩(wěn)定性受溫度的影響不大。結果表明，在50 ℃以下時，隨著溫度的升高，肌紅蛋白自動氧化程度隨著溫度的升高而增加[16]。但試驗結果顯示，在4～50 ℃、60 min內(nèi)血紅素輔基吸收峰強度無明顯差異，說明溫度可能會加快肌紅蛋白的氧化速率，即促進血紅素輔基上的二價鐵離子氧化成三價鐵離子[17]，但血紅素輔基的結構并未被破壞，在該溫度下血紅素輔基結構較穩(wěn)定。也有研究表明，當溫度達到70 ℃時，血紅素輔基特征峰消失，說明過高的溫度依然會破壞血紅素輔基的結構[16]。

2.3.3 pH值對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 圖8結果顯示，pH值在3～11間時，血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積有明顯差異(P<0.05)，pH值=9時最大，pH值小于9時逐漸降低。在堿性環(huán)境中血紅素輔基的吸收峰強度大于酸性環(huán)境中的，說明血紅素輔基在偏堿性環(huán)境下較穩(wěn)定，酸性環(huán)境會降低血紅素輔基的穩(wěn)定性，而且pH值越低，越不利于血紅素輔基結構的穩(wěn)定。血紅素輔基在不同pH值下吸收峰面積的變化，可能是由于其共軛體系被破壞或者鐵離子游離了出來。許多研究也顯示，肌紅蛋白在酸性條件下其特征峰吸收強度明顯降低，還有研究表明，在酸性條件下肌紅蛋白更易發(fā)生自氧化[18]，質(zhì)子取代反應是酸性條件下血紅素蛋白自動氧化加速的主要原因[19]，當pH值下降到3及以下時，肌紅蛋白血紅素輔基的結構會受到較大程度的破壞[20]。

2.3.4 鹽濃度對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 由圖9可以看出，對于氯化鈉質(zhì)量分數(shù)為1%～5%的肌紅蛋白樣品，其血紅素輔基在400 nm處的紫外吸收峰面積無明顯差異。說明在氯化鈉質(zhì)量分數(shù)為1%～5%的肌紅蛋白溶液中，其血紅素輔基結構的穩(wěn)定性基本不受鹽濃度的影響。有報道表明，在肌紅蛋白溶液中添加1%～5%的氯化鈉，肌紅蛋白的氧化程度無明顯變化，通過紫外掃描其在400 nm左右的特征吸收峰強度也無明顯差異，說明血紅素輔基的結構相對穩(wěn)定[21]。因此，將氯化鈉作為肉品中常用的添加劑時，在一定范圍內(nèi)，其對肌紅蛋白血紅素輔基的穩(wěn)定性無明顯影響。

2.3.5 次氯酸鈉對肌紅蛋白血紅素輔基的影響 從圖10可以看出，用1% NaClO(稀釋到pH值為12)處理后的樣品的峰面積明顯低于空白對照組，在開始的1 h時就有較大差異，峰面積較空白對照降低了8.72%，說明加入NaClO明顯破壞了血紅素輔基，使其在400 nm處的特征吸收峰降低。隨著時間推移，1% NaClO處理后的樣品的峰面積逐漸降低，在1～5 h 間其峰面積有顯著差異(P<0.05)，5 h時其吸收峰面積與空白對照相比降低了18.99%，5 h后則趨于平緩，說明NaClO對血紅素輔基的作用隨著處理時間的增加而逐漸增強，到5 h左右作用完全；空白組峰面積基本保持不變，說明血紅素輔基在該環(huán)境下是比較穩(wěn)定的。當加入5% NaClO(稀釋到pH值為12)時，液相色譜圖中原先肌紅蛋白的2個峰基本消失，說明該劑量的次氯酸鈉對肌紅蛋白、血紅素輔基的結構產(chǎn)生了很大的破壞。

次氯酸鈉反應后的分解產(chǎn)物是氯離子、氯酸根離子。由于工業(yè)生產(chǎn)中使用的亞氯酸鈉、次氯酸鈉的濃度都較低，且對豬肉的處理方法是浸泡，因此豬肉上殘留的防腐劑及防腐劑的分解產(chǎn)物是微量的，在這樣的范圍內(nèi)可認為是對人體無害的[22-23]。但是一定濃度的次氯酸鈉會破壞肌紅蛋白的血紅素輔基結構，所以在工業(yè)生產(chǎn)中，應控制次氯酸鈉的添加量以減少對血紅素輔基的影響，從而使肉色更加穩(wěn)定。

3 結論

上述試驗表明，在一定條件下，肌紅蛋白血紅素輔基損失隨處理時間的延長而持續(xù)增加；在4～50 ℃范圍內(nèi)，溫度對血紅素輔基結構穩(wěn)定性的影響不顯著；血紅素輔基在偏堿性環(huán)境下較穩(wěn)定，酸性環(huán)境會影響血紅素輔基的穩(wěn)定性，且pH值越低，越不利于血紅素輔基結構的穩(wěn)定；在一定質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)，氯化鈉不會破壞血紅素輔基的結構，不同鹽濃度下血紅素輔基的穩(wěn)定性無明顯差異；一定濃度的次氯酸鈉會破壞血紅素輔基的結構，并且隨著處理時間的延長，其作用越強。