拮抗凡隆氣單胞菌的海洋芽孢桿菌chenj-1的分離與鑒定

陳 靜， 夏艷秋， 顧冬瑩， 朱 強(qiáng)

(江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005)

芽孢桿菌被認(rèn)為兼有改善水生動物消化道和改良水環(huán)境的雙重功效，作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有著重要用途。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用得較多的芽孢菌主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。芽孢菌在生長過程中產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等水解酶系，幫助機(jī)體消化、吸收飼料，降低飼料系數(shù)；產(chǎn)生B族維生素及維生素C，有助于提高機(jī)體的免疫活性；同時代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，可降低消化道內(nèi)pH值和氨的濃度，維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，起到防病、抗菌的雙重作用。

凡隆氣單胞菌在醫(yī)學(xué)上稱維羅納氣單胞菌、維隆氣單胞菌，獸醫(yī)上常譯作凡隆氣單胞菌[1]，是近些年確定的氣單胞菌科的新種，能引起人的局部和系統(tǒng)感染[2]，同時在水產(chǎn)養(yǎng)殖上也逐漸成為危害性較大的病原菌。如該菌曾引發(fā)孟加拉國魚類的流行性潰瘍綜合征[3]。在國內(nèi)，該菌感染能使丁、羅非魚、中華絨螯蟹、泥鰍、甌江彩鯉等水產(chǎn)動物患病[4-8]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，氣單胞菌病的水產(chǎn)防治主要是靠水體消毒和內(nèi)服有效抗生素?？股貫E用帶來的耐藥菌產(chǎn)生存在公共安全衛(wèi)生隱患。所以，尋找綠色安全漁藥成為當(dāng)前的重點(diǎn)。本研究通過拮抗試驗(yàn)來篩選對凡隆氣單胞菌有抑制作用的菌株并對其抑制特性進(jìn)行研究，為開發(fā)水產(chǎn)微生物活性制劑提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發(fā)菌株：由筆者所在課題組分離自連云港海域海泥樣品中，共36株。

指示靶病原菌：凡隆氣單胞菌溫和生物型(Aeromonasveroniibiovar.sobria)NQ菌株(由淮海工學(xué)院秦蕾博士分離自發(fā)病泥鰍，人工感染試驗(yàn)證實(shí)為泥鰍發(fā)病的致病源)。

1.2 培養(yǎng)基

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 出發(fā)菌株對凡隆氣單胞菌NQ拮抗試驗(yàn) 初篩：將凡隆氣單胞菌NQ接種至TSB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，取100 μL涂布在TSB固體平板上，然后將出發(fā)菌株點(diǎn)種到涂布好的TSB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察拮抗效果及測量抑菌圈直徑。復(fù)篩：將出發(fā)菌株接種于TSB培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，將發(fā)酵液離心，取上清液用 0.22 μm 無菌濾膜過濾，在置于涂布凡隆氣單胞菌的TSA平板上的牛津杯中加入50 μL上述濾液。于28 ℃培養(yǎng)一定時間后，測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.2 菌株的分類鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征 參照文獻(xiàn)[9]，將菌株接種到TSA平板，于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)采用革蘭氏染色和簡單染色進(jìn)行觀察，并進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色觀察。

1.3.2.2 菌體的生理生化反應(yīng)研究 采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管鑒定。按照操作說明在細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中接入 50 μL 對數(shù)期菌株培養(yǎng)懸液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，18～24 h后觀察并記錄結(jié)果。

1.3.2.3 細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增與測序

1.3.2.3.1 細(xì)菌DNA提取 (1)取菌株過夜培養(yǎng)液1.5 mL于EP管中，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液。(2)加 567 μL TE緩沖液，用定量移液器吹打懸浮沉淀，并加30 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，15 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻，37 ℃保溫1 h。(3)加100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻；再加80 μL CTAB/NaCl溶液，混勻；65 ℃保溫10 min。(4)用等體積酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)抽提，離心4～5 min，將上清液移至干凈EP管。(5)加0.6～0.8倍體積的異丙醇，顛倒混合，冰箱冷凍層靜置15 min，沉淀DNA。(6)12 000 r/min 離心10 min使DNA沉淀，加40-TE溶解，-20 ℃ 保存。作為PCR模板。

1.3.2.3.2 PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計[10]：16S rDNA正向引物為(ALF165312)：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rRNA的通用引物(反向引物：ALF165313)：5′-CGGCTACCT-TGTTACGAC -3′，以上引物均由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。

基因PCR擴(kuò)增：50 μL PCR反應(yīng)體系：基因組DNA模板2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L MgCl24 μL，2.5 μmol/L dNTP 0.5 μL，2.5 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，5 U/μLTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa)0.5 μL，最后加無菌雙蒸水至50 μL，混合。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢查并拍照。PCR產(chǎn)物純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。

1.3.2.5 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析 將所測定的16S rDNA序列通過NCBI-NLM中Nucleotide-nucleotide Blast程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中核苷酸序列進(jìn)行同源性分析[11]，并通過數(shù)據(jù)庫下載與試驗(yàn)菌株親緣關(guān)系較近并已經(jīng)確證的序列，用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，采用MEGA 4軟件的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 菌株生長曲線以及不同時間段發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的研究 將菌株培養(yǎng)過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，分別取不同時間培養(yǎng)液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發(fā)酵離心清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發(fā)酵時間抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡隆氣單胞菌拮抗分離、篩選

通過對36株出發(fā)菌株初篩和復(fù)篩試驗(yàn)，得到1株對凡隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)NQ拮抗活性明顯的菌株 chenj-1。由表1、圖1可知，菌株chenj-1對凡隆氣單胞菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，并且可知其主要拮抗物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。

表1 chenj-1菌株對凡隆氣單胞菌的拮抗效果

2.2 菌株的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株chenj-1在TSB培養(yǎng)基上呈淡黃色菌落，表面粗糙，邊緣不整齊。由圖2可知，菌株chenj-1革蘭氏染色呈陽性，短桿狀、兩端鈍圓，多單個或成對出現(xiàn)，有芽孢，芽孢囊稍有膨大、呈橢圓形，中生到次端生，有稀疏的周生鞭毛。根據(jù)形態(tài)特征初步判斷菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.3 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)表2、圖2，結(jié)合生理生化鑒定和細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[12]及常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[9]對菌株chenj-1初步歸類為革蘭氏陽性芽孢桿菌屬。

表2 菌株chenj-1生理生化反應(yīng)

2.4 菌株chenj-1 16S rDNA序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像可知，引物擴(kuò)增出的序列長度約為1.5 kb(圖3)，符合常規(guī)的16S rDNA序列長度。

經(jīng)測序，菌株chenj-1 16S rDNA核苷酸序列大小為 1 398 bp，其序列已在GenBank中登記，登記號為JN051503。經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的16S rDNA核苷酸序列比對，選取芽孢桿菌屬各種的16S rDNA核苷酸序列與菌株的16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知，菌株與B.amyloliquefacien(X60605、AY608741、AY603658、DQ993675)位于同一簇群，親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA核苷酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株初步鑒定為海洋解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.5 菌株chenj -1生長曲線及不同發(fā)酵時間抑菌活性

將菌株chenj -1培養(yǎng)過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)(28 ℃，160 r/min)，分別取不同時間發(fā)酵液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發(fā)酵離心上清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發(fā)酵時間抑菌圈大小。

由圖5可知，菌株chenj-1生物量在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，28 h發(fā)酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑為 15.8 mm，說明抑菌活性物質(zhì)在穩(wěn)定期大量產(chǎn)生并在穩(wěn)定中后期積累，對于擴(kuò)大生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌屬被認(rèn)為是一類產(chǎn)生多種抗微生物活性物質(zhì)的微生物[13-14]，而解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一員，也有不少文獻(xiàn)展示其在抑制病原微生物方面的活性，楊勝遠(yuǎn)等獲得1株解淀粉芽孢桿菌K6菌株有廣譜抗菌活性，包括對細(xì)菌、酵母、霉菌和白色念珠菌都具有抑制作用[15]，Lim等從解淀粉芽孢桿菌RX7菌株分離了1種廣譜拮抗多種病原細(xì)菌和白色念珠菌的細(xì)菌素[16]；而Seung等、Alvindia等和Calvo等分別獲得具有控制植物真菌性病原微生物的解淀粉芽孢桿菌菌株CNU114001、DGA14、BUZ-1[17-19]。

本試驗(yàn)采集江蘇省連云港及附近海域海泥、海水及海洋生物樣品，分離得到36株海洋芽孢桿菌并從中篩選到1株強(qiáng)拮抗凡隆氣單胞菌的菌株chenj -1。通過形態(tài)學(xué)、生理生化(包括耐鹽性)試驗(yàn)及16S rDNA基因比對初步歸類為海洋解淀粉芽孢桿菌。在對菌株chenj -1生長曲線及其不同時間段發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抑菌活性初步研究發(fā)現(xiàn)，菌株生物量與代謝活性產(chǎn)物量呈正相關(guān)，生物量在20 h達(dá)到最大值并進(jìn)入平衡期， 28 h發(fā)酵液抑菌圈直徑最大(15.8 mm)。試驗(yàn)結(jié)果為生物防治由凡隆氣單胞菌引起的水產(chǎn)動物疾病提供了理論依據(jù)。經(jīng)初步試驗(yàn)，B.amyloliquefacienchenj-1其硫酸銨鹽析產(chǎn)物抑菌活性有所提高，但具體活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組分需要進(jìn)一步研究。