賀蘭山東麓不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄的根系抗寒性

宋 瑞， 王洪睿， 張軍翔

(寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021)

寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓屬于葡萄冷涼產區(qū)，是一個天然的葡萄低溫馴化帶，釀酒葡萄品種赤霞珠、美樂已在當地栽種多年。目前，研究植物品種抗寒性及其鑒定方法的較多。牛錦鳳等對鮮食葡萄與釀酒葡萄品種的抗寒性研究表明，抗寒性強的品種電導率相對較低，變化幅度較小，電導率可作為鑒定品種抗寒性的重要指標[1]。李俊才等測定16個梨品種的枝條電導率發(fā)現(xiàn)，抗寒品種的電解質升高速度和幅度比不抗寒的品種要小[2]。王淑杰等研究葡萄的抗寒性發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的品種含糖量要比抗寒性弱的高；在低溫鍛煉過程中，各個葡萄品種的可溶性糖含量增加，其中抗寒性強的品種增加幅度更大[3]。楊希等對美麗針葵研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，美麗針葵的丙二醛含量增加，經過低溫鍛煉的美麗針葵丙二醛含量增加幅度比未經低溫鍛煉的小[4]。付曉偉等認為，當植物受到低溫脅迫時，細胞體內的一些物質會發(fā)生變化，如果溫度持續(xù)降低，其變化具有一定的規(guī)律性，人們可測量這些物質的變化，鑒定不同品種的抗寒屬性[5]。本試驗以經過多年天然低溫馴化、種植在寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓的釀酒葡萄品種赤霞珠、美樂為材料，研究不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的抗寒性，為當地赤霞珠、美樂葡萄的抗寒馴化工作提供技術支撐，同時為當地不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根部冬季防寒管理提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2016年11月20日至12月20日進行。3年生赤霞珠、美樂葡萄來自寧夏大學葡萄酒學院種植實訓基地，10、15年生赤霞珠、美樂葡萄來自寧夏御馬酒莊種植基地，選用當年生葡萄根系用于試驗，根系分布范圍為30～40 cm土層，直徑為3～4 mm。

1.2 處理方法

將采集到的根系用自來水清洗2遍，再用去離子水清洗1遍，放入密封袋中，抽出空氣，置于恒溫冰箱中4 ℃保持，待測；在盡量保持根系不受到破壞的情況下，分別稱取根系4 g，放入密封袋，抽出空氣，分別放入-3、-6、-9、-12 ℃低溫培養(yǎng)箱中進行處理，降溫至目的溫度后持續(xù)12 h，以4 ℃處理為對照；取出樣品逐步升溫至4 ℃，測定相關指標。

1.3 測定內容與方法

1.3.1 相對電導率及半致死溫度 分別取低溫處理的葡萄根系1 g，用剪刀剪取2～5 mm厚的薄片，置于裝有去離子水10 mL、具塞的試管中，振蕩3 min；多次振蕩，6 h后測定初電導率值(C1)；將試樣煮沸30 min，室溫冷卻，靜置12 h，測定終電導率值(C2)，計算相對電導率，公式為

相對電導率=C1/C2×100%。

結合相對電導率擬合Logistic方程，計算各葡萄材料根系的半致死溫度LT50。

1.3.2 可溶性糖含量 取0.2 g低溫處理的根系，加去離子水研磨至糊狀；倒入試管中，加入去離子水10 mL，蓋好塞子，水浴中煮30 min；冷卻，用漏斗過濾，多次沖洗殘渣，并于 50 mL 容量瓶中定容；靜置20 min，取上層澄清稀釋液0.5 mL至試管中，依次加入蒸餾水1.5 mL、蒽酮乙酸乙酯1 mL、濃硫酸4 mL，混勻，立即放入沸水中準確保溫20 min；取出，冷卻10 min，以水為對照，測量波長為620 nm的吸光度(D620 nm)；根據標準曲線，計算可溶性糖含量，單位mg/g?？扇苄蕴呛坑嬎愎綖?/p>

可溶性糖含量=8.166×(0.107 1D620 nm-0.007 4)。

1.3.3 丙二醛(MDA)含量 取經過低溫處理的葡萄根系 0.1 g，加入10%三氯乙酸(TCA)1 mL，充分研磨至均漿；加入10% TCA 4 mL，倒入離心管中，6 000 r/min離心15 min；取上清液4 mL，加0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 4 mL，搖勻，沸水浴30 min；冷卻，6 000 r/min離心15 min；取上清液，以TBA 4 mL+水4 mL為對照，用分光光度計分別測定波長為450、532、600 nm處的吸光度，計算丙二醛含量，公式為

MDA含量(μmol/L)=6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56×D450 nm。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對葡萄根系相對電導率的影響及半致死溫度的確定

由圖1可知，隨著處理溫度的下降，不同樹齡葡萄的相對電導率整體呈“S”形上升趨勢，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄間差異明顯；4 ℃對照處理中，除15年生美樂葡萄的相對電導率較低外，其他樣品的相對電導率在50%左右；處理溫度由-9 ℃到-12 ℃，3年生赤霞珠、3年生美樂、15年生美樂葡萄的相對電導率增長率低于5%；-12 ℃處理中，不同樹齡不同品種的相對電導率達到90%左右，說明這些樣品均受到凍害，其細胞膜系統(tǒng)發(fā)生不可逆破壞。

對赤霞珠、美樂葡萄根系相對電導率與溫度進行Logistic方程擬合，擬合度均大于0.85，說明該擬合度較好，結果可信[6]。由表1可知，隨著葡萄樹齡的增大，赤霞珠、美樂的根系抗寒性增強，且兩者抗寒性增強的程度有一定差異；3、10、15年生赤霞珠葡萄根系的半致死溫度分別為-3.12、-6.30、-12.16 ℃，3～15、3～10、10～15年生樹齡的半致死溫度增加速度分別為0.75、0.45、1.17 ℃/年，而3、10、15年生美樂葡萄的半致死溫度分別為-3.26、-5.14、-5.57 ℃，3～15、3～10、10～15年生樹齡的半致死溫度增加速度分別為0.19、0.27、0.09 ℃/年，說明栽種在賀蘭山東麓的赤霞珠葡萄根系的半致死溫度受樹齡影響較大，影響持續(xù)時間較長，而美樂葡萄根系的半致死溫度也受樹齡的影響較小，且隨樹齡的增加而減弱。

表1 赤霞珠、美樂葡萄根系相對電導率與溫度的Logistic方程及半致死溫度

注：y為相對電導率，x為溫度。

2.2 低溫處理對赤霞珠及美樂葡萄根系可溶性糖含量的影響

可溶性糖含量與植物抗寒性有一定的關系[7]。在低溫逆境下，可溶性糖可以促進細胞分泌脫落酸(ABA)、合成脂肪和蛋白質，而脂肪和蛋白質可以結合細胞中的自由水，ABA可以調節(jié)細胞的滲透率，促進抗寒基因的表達，產生大量的抗寒物質抵御逆境以保持細胞內外環(huán)境的平衡。由圖2可知，隨著處理溫度的下降，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的可溶性糖含量呈先升后降趨勢，除15年生赤霞珠葡萄根系可溶性糖含量在-9 ℃達到峰值外，其他處理均在-6 ℃時達到峰值，其中3年生美樂葡萄根系可溶性糖含量相對最高，達到2.57mg/g，其他處理的峰值在1.54～1.84mg/g之間；-3、-6 ℃處理的不同樹齡赤霞珠葡萄根系可溶性糖含量差別較小，但隨著溫度的進一步降低，3年生赤霞珠葡萄根系的可溶性糖含量下降明顯，-12 ℃處理的可溶性糖含量與對照處理大致相同，而10、15年生赤霞珠葡萄根系的可溶性糖含量下降不明顯，且維持在較高水平；-3、-6 ℃處理的不同樹齡美樂葡萄根系可溶性糖含量差別較大，-6 ℃溫度處理下，3年生美樂葡萄根系可溶性糖含量明顯高于其他樹齡的美樂葡萄，隨著溫度的進一步降低，不同樹齡美樂葡萄根系的可溶性糖含量均有明顯下降，說明溫度過低時美樂葡萄根系細胞死亡，無法合成可溶性糖。

2.3 低溫處理對赤霞珠及美樂葡萄根系丙二醛含量的影響

由圖3可知，4 ℃對照處理下，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的丙二醛含量差異較大，10年生美樂葡萄根系的丙二醛含量相對最高，為0.289μmol/L，3年生赤霞珠葡萄相對最低，為0.158μmol/L；隨著處理溫度的降低，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的丙二醛含量多呈上升趨勢；赤霞珠葡萄根系-12 ℃低溫處理與4 ℃對照處理相比，不同樹齡根系的丙二醛含量增長率均超過25%，受溫度影響較為明顯，而美樂葡萄根系-12 ℃低溫處理與4 ℃對照處理相比，3年生美樂根系的丙二醛含量由對照處理的0.171μmol/L增長至 -12 ℃ 處理的0.210μmol/L，增長率為22.8%，而10、15年生美樂葡萄根系丙二醛含量增長率僅約為2%。

3 結論與討論

一般認為，植物在低溫脅迫下細胞的質膜透性會增大，細胞液會有不同程度的外滲，導致細胞外電解質濃度升高，電導率會有不同程度的增大[8]，而葡萄根系煮沸前后電導率的比值(相對電導率)能夠真實反映不同品種的抗寒性差異[9]。對根據相對電導率和溫度擬合的logistic方程進行求導，所得函數峰值即為電導率變化最快的溫度，當外界溫度低于此溫度，植物將受到不可逆的破壞，該溫度被稱為植物的半致死溫度，是用來鑒定植物抗寒性的經典方法[10]。本試驗分別對生長于寧夏回族自治區(qū)賀蘭山東麓的15、10、3年生赤霞珠、美樂葡萄根系進行-3、-6、-9、-12 ℃低溫處理12h，以4 ℃處理作為對照，測定根系的相對電導率、可溶性糖含量、丙二醛含量，并對測定的相對電導率和溫度擬合logistic方程，計算葡萄根系的半致死溫度。結果表明，隨著處理溫度的降低，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系相對電導率多呈“S”形曲線上升，其上升幅度與樹齡有明顯關系，且以Logistic方程y=1/(1/k+b0×b1x)來描述相對電導率與溫度的關系時具有較好的擬合度，達到85%以上，具有較高的可信度；隨著樹齡的增加，栽種在寧夏賀蘭山東麓的赤霞珠、美樂根系半致死溫度降低，3、10、15年生赤霞珠葡萄根系半致死溫度分別為 -3.12、-6.30、-12.16 ℃，3、10、15年生美樂葡萄根系半致死溫度分別為-3.26、-5.14、-5.57 ℃，3～15年生赤霞珠、美樂葡萄根系半致死溫度下降速度分別為0.75、0.19 ℃/年，經過多年低溫馴化的赤霞珠、美樂葡萄根系抗寒性得到增強，而這種根系抗寒性的提升與可溶性糖、丙二醛含量變化有關。

當植物受到寒害時，可溶性糖含量的增加可使細胞滲透濃度提高，滲透壓、冰點降低[11]，在低溫逆境下植物體內多糖被水解，并主要以可溶性糖形式存在，而可溶性糖作為細胞保護物質，其含量變化與植物抗寒性呈正比。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理溫度的降低，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系可溶性糖含量呈先升后降趨勢，除15年生赤霞珠葡萄根系可溶性糖含量在-9 ℃達到峰值外，其他處理均在-6 ℃時達到峰值，且在更低溫度處理時，可溶性糖含量下降與樹齡關系明顯；-12 ℃ 低溫處理時，3年生赤霞珠葡萄根系的可溶性糖含量與對照大致相同，而10、15年生赤霞珠根系可溶性糖含量明顯高于對照處理，且維持在較高水平，在1.69mg/g以上，這說明在-12 ℃低溫下，隨著樹齡的增大，赤霞珠葡萄根系水解生成可溶性糖的能力增強，從而其抗寒性增強。

丙二醛是細胞膜中一些物質發(fā)生化學反應的最終產物，可以毒害生物膜，抑制一些抗寒脂肪、蛋白的合成，其含量高低可判定生物膜的損傷程度。本試驗結果表明，在4 ℃對照處理下，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的丙二醛含量差異較大，10年生美樂葡萄根系的丙二醛含量相對最高，為 0.289μmol/L，3年生赤霞珠葡萄相對最低，為 0.158μmol/L；隨著處理溫度的降低，不同樹齡赤霞珠、美樂葡萄根系的丙二醛含量多呈上升趨勢，這是赤霞珠、美樂葡萄抗寒脅迫的重要反應機制；赤霞珠葡萄根系-12 ℃低溫處理與4 ℃對照處理相比，不同樹齡根系的丙二醛含量增長率均超過25%，受溫度影響較為明顯，而美樂葡萄根系-12 ℃低溫處理與4 ℃對照處理相比，3年生美樂根系的丙二醛含量由對照處理的0.171μmol/L增長至-12 ℃處理的 0.210μmol/L，增長率為22.8%，而10、15年生美樂葡萄根系丙二醛含量增長率僅約為2%，較高樹齡的美樂葡萄根系丙二醛含量增長率遠低于較低樹齡的增長率，這是高樹齡美樂葡萄抗寒性提高的重要原因之一。