基于雙重信號(hào)放大的電化學(xué)免疫法對(duì)前列腺特異性抗原的檢測(cè)

李 雪，艾永玲，何群葉，楊功俊，王 菁,*

(中國(guó)藥科大學(xué) 1醫(yī)藥生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

腫瘤標(biāo)志物在癌癥早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要的臨床價(jià)值。前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占全球癌癥發(fā)病率第5位[1]。其檢測(cè)手段中,血清前列腺特異抗原(PSA)是最重要的早期檢測(cè)指標(biāo)[2]。一般情況下，PSA正常值小于4 ng/mL，當(dāng)前列腺癌發(fā)生時(shí)其質(zhì)量濃度大于10 ng/mL[3]。因此，及時(shí)并準(zhǔn)確地檢測(cè)PSA在前列腺癌的預(yù)測(cè)和診斷中至關(guān)重要。

在腫瘤標(biāo)志物的不同分析方法中，電化學(xué)分析法因具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而倍受青睞[4]。但由于免疫分析中抗原/抗體都是非電活性的，因此往往需要對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記。量子點(diǎn)(QDs)因其獨(dú)特的光學(xué)性質(zhì)及良好的生物相容性而被廣泛地應(yīng)用于生物傳感、免疫分析和生物成像等多個(gè)方面[5-8]。除此之外，QDs還具備良好的電化學(xué)特性，利用QDs吸收轉(zhuǎn)化光子和轉(zhuǎn)移電子的能力，通過(guò)方波溶出伏安法(SWSV)可直接反映為電流響應(yīng)信號(hào)[9]，因而QDs常被用作信號(hào)標(biāo)記物。Liu等[10]基于葉酸修飾的CdSe/ZnS QDs實(shí)現(xiàn)了對(duì)KB細(xì)胞的高靈敏檢測(cè)。Chen等[11]利用CdS QDs和適配體滾環(huán)擴(kuò)增放大技術(shù)進(jìn)行赭曲霉毒A的檢測(cè)。利用QDs中金屬元素并結(jié)合高靈敏的溶出伏安法，可實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤標(biāo)志物的電化學(xué)免疫分析。

為了進(jìn)一步提高免疫傳感的靈敏度，已有大量的研究工作致力于利用各種納米材料來(lái)放大檢測(cè)信號(hào)[12-13]。還原氧化石墨烯(rGO)是石墨烯的一種重要衍生物，具有熱學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性、比表面積大、生物相容性好以及導(dǎo)電性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[14]。AuNPs同樣有較大的比表面積，良好的電化學(xué)特性，此外其有較強(qiáng)的吸附能力，可用于裝載含有-NH2、-SH的物質(zhì)[15]。因而，兩種材料在免疫分析方面得到廣泛應(yīng)用。

基于以上出發(fā)點(diǎn)，本研究采用水溶性量子點(diǎn)GSH-CdTe作為信號(hào)標(biāo)記物，利用rGO和AuNPs自身獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，直接和間接地增加信號(hào)物的量，以此構(gòu)建了雙重信號(hào)放大的電化學(xué)免疫傳感法。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，采用SWSV對(duì)酸解的Cd2+進(jìn)行測(cè)定，其峰電流對(duì)應(yīng)這個(gè)目標(biāo)物的濃度，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物PSA的靈敏檢測(cè)。

1 材 料

1.1 試 劑

Anti-PSA Ab1(PSA抗體1，1.9 mg/mL)、Anti-PSA Ab2(PSA抗體2，1.7 mg/mL)、PSA抗原(0.5 mg/mL)(上海領(lǐng)潮生物科技有限公司)；碲粉(Te，99.99%)、CdCl2·2.5H2O(≥99.0%)、還原型谷胱甘肽(GSH，98%)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，98%)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛血清蛋白(BSA,Solarbio公司)；氧化石墨烯分散液(0.5 mg/mL，南京先鋒納米科技有限公司)；氯金酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。其他試劑均為分析純并直接使用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)用水均為超純水(電阻系數(shù)≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)，所用PBS緩沖液pH均為7.4，濃度為0.1 mol/L。

1.2 儀 器

電化學(xué)工作站(CHI，上海辰華儀器有限公司)；UV-3600紫外可見(jiàn)吸收光譜儀，IRAffinity-1S紅外光譜儀(日本島津公司)；2000型透射電子顯微鏡(TEM，日本Jeol公司)。

2 方 法

2.1 不同粒徑AuNPs的制備

制備AuNPs之前所有的玻璃器皿在新鮮配制的王水(HNO3-HCl，1∶3)中浸泡12 h，用超純水洗凈，烘干備用。

直徑5 nm的AuNPs按照文獻(xiàn)[6]方法制備并稍做改進(jìn)，具體步驟為：將0.1 mol/L冰浴后的NaBH4溶液0.6 mL加入到2.5×10-4mol/L HAuCl4的水溶液20 mL中，隨著攪拌，溶液迅速變成橙紅色，為了保證AuNPs的生成，在持續(xù)冰浴條件下攪拌3 h，直至溶液顏色變?yōu)榫萍t色。制備的AuNPs于4 ℃下儲(chǔ)存。

20 nm粒徑的AuNPs參照文獻(xiàn)[16]方法制備。取1% NaBH4水溶液10 mL快速加入到含HAuCl410 mg的沸水190 mL中，劇烈攪拌并煮沸30 min，然后待反應(yīng)溶液自然冷卻至室溫，得到酒紅色的20 nm AuNPs溶液，同樣保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 GSH-CdTe QDs的合成

將碲粉125 mg和NaBH4200 mg加入到裝有超純水10 mL的圓底燒瓶中，N2環(huán)境下磁力攪拌劇烈反應(yīng)10 min，然后密封，在冰浴中攪拌30 min得到NaHTe溶液。將CdCl2·2.5H2O 554.3 mg和GSH水溶液350 μL加入到水250 mL中以形成Cd前驅(qū)溶液。然后用1 mol/L NaOH調(diào)pH至10，并向該溶液中通N230 min除氧。最后將新鮮制備的NaHTe溶液在N2環(huán)境下注入到Cd前驅(qū)溶液中，攪拌20 min后，在95 ℃通氮?dú)鈼l件下加熱回流3 h得到GSH-CdTe QDs。反應(yīng)結(jié)束后用無(wú)水乙醇反復(fù)離心洗滌3次，最后分散于超純水中并于4 ℃下保存[17]。

2.3 AuNPs@GSH-CdTe復(fù)合物及信號(hào)標(biāo)記物的制備

GSH-CdTe QDs與20 nm的AuNPs按照質(zhì)量濃度比5∶1的比例混合，室溫下攪拌過(guò)夜，反應(yīng)物分別用無(wú)水乙醇和超純水離心洗滌，得到AuNPs@GSH-CdTe復(fù)合物并分散在水溶液中[18]。信號(hào)標(biāo)記物的制備過(guò)程如圖1所示，具體為:AuNPs@GSH-CdTe 500 μL中加入20 mg/mL EDC溶液和10 mg/mL NHS溶液各25 μL，室溫下振蕩反應(yīng)1 h。在這里EDC和NHS的作用是活化ODs表面的羧基，用以更好地與抗體連接。接下來(lái)，再向混合液中加入100 μg/mL PSA Ab1溶液50 μL，繼續(xù)室溫混合振蕩2 h。最后將5%的BSA溶液50 μL加入到上述溶液中繼續(xù)振蕩1 h，用以封閉QDs表面的活性位點(diǎn)。最終反應(yīng)物用PBS溶液離心洗滌2次，并重新分散在PBS溶液500 μL中，所制信號(hào)標(biāo)記物4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

Figure1 Synthesis process of AuNPs@GSH-CdTe-Ab1

QDs:Quantum dots

2.4 rGO/AuNPs及rGO/AuNPs-Ab2制備

首先，取0.5 mg/mL GO分散液5 mL至圓底燒瓶中，并向其中加入適量的NaBH4，在80 ℃條件下持續(xù)攪拌并回流5 h，所得產(chǎn)物rGO用超純水洗滌數(shù)次。其次，將所得的rGO再次分散于水4 mL中。接著，在上述rGO的水溶液中加入5 nm的AuNPs溶液5 mL，并室溫下攪拌過(guò)夜，最終得到rGO/AuNPs復(fù)合材料[19]。

取rGO/AuNPs復(fù)合材料溶液300 μL轉(zhuǎn)移至0.2 mL離心管中，用PBS緩沖液清洗2次。再向離心管中加入10 μg/mL PSA Ab2溶液500 μL，室溫下混合振蕩2 h，用PBS緩沖溶液離心洗滌。隨后再向離心管中加入5%的BSA 100 μL，繼續(xù)室溫下混合振蕩1 h，PBS離心洗滌，此處的BSA是用以封閉rGO/AuNPs復(fù)合材料上的活性位點(diǎn)，減少非特異性吸附。所制得的rGO/AuNPs-Ab2于4 ℃下保存?zhèn)溆?圖2)。

2.5 基于納米復(fù)合材料的電化學(xué)免疫檢測(cè)

圖3為“三明治”電化學(xué)免疫測(cè)定過(guò)程示意圖。首先將不同濃度PSA抗原溶液500 μL加入到離心管中，與rGO/AuNPs-Ab2在37 ℃下反應(yīng)40 min，反應(yīng)完成后，離心洗滌2次。然后加入AuNPs@GSH-CdTe-Ab1信號(hào)標(biāo)記物，37 ℃水浴振搖1 h，根據(jù)形成“三明治”免疫結(jié)構(gòu)形成前后相對(duì)分子質(zhì)量的變化，使用100 kD的超濾膜將未與抗原結(jié)合的AuNPs@GSH-CdTe-Ab1標(biāo)記物離心去除，得到最終檢測(cè)的“三明治”免疫夾心結(jié)構(gòu)。

本工作采用三電極體系對(duì)體系進(jìn)行檢測(cè)：玻碳電極(GCE，直徑3 mm)作為工作電極，飽和甘汞電極作為參比電極，鉑電極作為輔助電極。GCE在使用前用金相砂紙進(jìn)行打磨，再用粒徑為0.05 μm的Al2O3懸濁液在絨布上拋光，得到明亮的鏡面。在濃度為0.5 mol/L鐵氰化鉀溶液中利用循環(huán)伏安法(CV)表征電極性能。

為了檢測(cè)信號(hào)標(biāo)記物中溶解出的Cd2+，采用SWSV對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)，首先，用0.1 mol/L的硝酸溶液500 μL溶解上述所得的免疫夾心結(jié)構(gòu)中的Cd2+。其次，將得到的硝酸溶液(含有溶解的Cd2+)和900 μL含有10 mg/L Hg2+的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 4.6)混合，并轉(zhuǎn)移至電化學(xué)池中測(cè)定。最后SWSV測(cè)定，過(guò)程為：先在-1.2 V電位下電沉積120 s，沉積時(shí)磁力攪拌。然后電位從-1.0 V掃描至-0.3 V，電位掃描區(qū)間為N2保護(hù)下進(jìn)行。方波參數(shù)為：靜置時(shí)間10 s，振幅為25 mV，電位增量為4 mV，頻率15 Hz。

Figure2 Synthesis process of rGO/AuNPs-Ab2

Figure3 Principle of double signal enhancing strategy for PSA detection

PSA:Prostate specific antigen

3 結(jié)果與討論

3.1 GSH-CdTe QDs的表征

由水熱法制備所得的GSH-CdTe QDs，利用透射電子顯微鏡(TEM)、紫外可見(jiàn)吸收光譜儀(UV-vis)以及紅外光譜儀(IR)對(duì)其進(jìn)行表征，如圖4所示。從圖4-A可以看出，GSH-CdTe QDs約在370 nm處出現(xiàn)一個(gè)UV-vis吸收峰，根據(jù)文獻(xiàn)可計(jì)算出其粒徑約為5.2 nm[20]，同時(shí)與粒徑分布圖集中顯示的4～6 nm一致。TEM圖也顯示出，GSH-CdTe QDs具有良好的分散性，顆粒近似呈球狀，粒徑大小分布比較均勻，約為5 nm，這與UV-vis結(jié)果一致。IR譜圖可以觀察到N-H的伸縮振動(dòng)峰在3 425 cm-1，而GSH中S-H的伸縮振動(dòng)峰在2 534 cm-1處基本消失，由此可見(jiàn)，GSH與QDs之間形成了S-Cd鍵，此外，-COOH不對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰由GSH中的1 720 cm-1移至1 606 cm-1，同時(shí)在1 380 cm-1處出現(xiàn)了-COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明保護(hù)劑GSH以負(fù)離子的形式存在。

3.2 AuNPs及其復(fù)合物材料的表征

圖5為制備的單純AuNPs和它的復(fù)合材料UV-vis表征圖。從圖中可以看到5和20 nm的AuNPs均在520 nm左右有吸收峰，此峰為AuNPs的特征吸收峰(圖5-A曲線a，圖5-B曲線a)。此外，AuNPs@GSH-CdTe的曲線(圖5-A曲線b)較20 nm AuNPs而言，在380 nm處有明顯地GSH-CdTe QDs吸收，且QDs的量遠(yuǎn)大于AuNPs。以此可以說(shuō)明20 nm的AuNPs可作為很好的納米載體，負(fù)載大量的信號(hào)物質(zhì)QDs，達(dá)到信號(hào)放大的目的。對(duì)比5 nm AuNPs的吸收，rGO/AuNPs的UV-vis吸收(圖5-B曲線b)除了AuNPs的特征峰外還在280 nm左右處有了rGO的特征吸收峰，同時(shí)rGO/AuNPs復(fù)合物的形成使得AuNPs的吸收有少許藍(lán)移，證明復(fù)合物的成功制備。

Figure4 Characterization of ODs.A:UV-vis absorption spectra of GSH-CdTe QDs solution,inset:Corresponding size distribution of GSH-CdTe QDs；B:TEM image of GSH-CdTe QDs；C:FT-IR spectra of GSH-CdTe QDs

Figure5 UV-vis absorption spectra of (A):20 nm AuNPs (a) and AuNPs@GSH-CdTe (b);and (B):5 nm AuNPs (a) and rGO/AuNPs (b)

3.3 rGO和rGO/AuNPs復(fù)合物的TEM表征

為進(jìn)一步證明rGO/AuNPs復(fù)合物的生成，利用TEM直觀地對(duì)rGO和rGO/AuNPs復(fù)合物進(jìn)行形貌表征，如圖6所示。純r(jià)GO呈表面褶皺的單層片狀結(jié)構(gòu)，形成rGO/AuNPs復(fù)合物后，明顯看出，5 nm AuNPs均勻地鑲嵌在rGO表面，AuNPs的存在能更加有利于生物分子的結(jié)合，同時(shí)也增大了rGO的生物結(jié)合面積，使得其表面能更加有效地放大交聯(lián)PSA Ab2的數(shù)量。

Figure6 TEM image of (A) rGO and (B) rGO/AuNPs

3.4 雙重信號(hào)放大免疫傳感的實(shí)現(xiàn)

實(shí)驗(yàn)中，利用AuNPs@GSH-CdTe復(fù)合材料標(biāo)記PSA Ab1，“三明治”免疫反應(yīng)后，將rGO/AuNPs表面所反應(yīng)結(jié)合到的GSH-CdTe QDs用HNO3溶解，采用SWSV來(lái)檢測(cè)酸解的Cd2+峰電流，從而達(dá)到定量檢測(cè)抗原PSA的目的。因?yàn)镃dTe的量正比于相應(yīng)的抗原，故產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)可以指示PSA的量。體系中使用的20 nm的AuNPs具有較大的比表面積，能夠負(fù)載更多的CdTe信號(hào)分子，可以直接地增加Cd2+量，達(dá)到一重信號(hào)放大的作用。而rGO/AuNPs復(fù)合物不僅更適合抗體的組裝，也能增加抗體的數(shù)量，從而間接地增加Cd2+量，達(dá)到二重信號(hào)放大的效果。當(dāng)體系中存在50 ng/mL的目標(biāo)抗原PSA時(shí)，利用這些復(fù)合納米材料，可以得到一個(gè)很顯著的Cd2+電化學(xué)信號(hào)(圖7曲線a)。然而，當(dāng)體系中沒(méi)有PSA存在時(shí)，AuNPs@GSH-CdTe-Ab1信號(hào)標(biāo)記物無(wú)法結(jié)合到rGO/AuNPs表面上，因此經(jīng)過(guò)洗滌后酸解無(wú)Cd2+的信號(hào)峰(曲線b)，這得以證明免疫傳感的特異性，并為后續(xù)的定量分析提供了良好的背景信號(hào)。為了更明確AuNPs和rGO在信號(hào)放大方面所起作用，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下(PSA 50 ng/mL)做了兩個(gè)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，當(dāng)以單獨(dú)的QDs作為信號(hào)標(biāo)記物時(shí)，僅有較弱的信號(hào)產(chǎn)生(曲線c)，證明GSH-CdTe QDs的含量直接影響信號(hào)大小。同樣，若rGO未參與反應(yīng)體系時(shí)，AuNPs所裝載的抗體較少，導(dǎo)致后續(xù)免疫反應(yīng)的量也減少，電化學(xué)信號(hào)減弱(曲線d)。為了進(jìn)一步確定采用三明治夾心結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)，僅用AuNPs@GSH-CdTe標(biāo)記Ab1。檢測(cè)過(guò)程中，使得目標(biāo)抗原與AuNPs@GSH-CdTe-Ab1直接反應(yīng)，即體系中不存在二抗。反應(yīng)結(jié)束后使用50 kD的超濾膜離心去除未結(jié)合抗原的信號(hào)標(biāo)記物，最終產(chǎn)生的信號(hào)如圖7曲線e所示?？梢钥闯?，相較于使用二抗載體來(lái)說(shuō)，該結(jié)構(gòu)的信號(hào)更弱，這可能是由于缺少二抗載體，抗原和信號(hào)分子直接結(jié)合，空間位阻減小，會(huì)發(fā)生一個(gè)信號(hào)分子與多個(gè)抗原結(jié)合的情況，從而使得檢測(cè)到的Cd2+電流較弱。因此，所構(gòu)建的三明治免疫傳感方法可以通過(guò)納米復(fù)合材料得到有效的雙重信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)對(duì)PSA的靈敏檢測(cè)。

Figure7 SWSVs of Cd2+responding to different assembled mode

a:AuNPs@GSH-CdTe-Ab1-PSA-Ab2-AuNPs/rGO；b:without PSA；c:GSH-CdTe-Ab1-PSA-Ab2-AuNPs/rGO；d:AuNPs@GSH-CdTe-Ab1-PSA-Ab2-AuNPs；e:GSH-CdTe-Ab1-PSA.The concentration of PSA is all 50 ng/mL

3.5 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了高靈敏地檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物PSA，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，包括AuNPs@GSH-CdTe-Ab1的用量、BSA的濃度和PSA的孵育時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)用Cd2+的溶出峰電流作為代表來(lái)考察各個(gè)因素的影響。

信號(hào)標(biāo)記物的多少將決定最終的信號(hào)強(qiáng)弱，因而，首先考察了AuNPs@GSH-CdTe-Ab1的用量對(duì)其電化學(xué)信號(hào)的影響。圖8-A為不同體積的AuNPs@GSH-CdTe標(biāo)記抗體與Cd2+溶出峰電流之間的關(guān)系圖。結(jié)果表明，隨著AuNPs@GSH-CdTe-Ab1加入量的增加，溶出峰電流也隨之增大，當(dāng)加入體積超過(guò)30 μL后，Cd2+的溶出峰電流基本平穩(wěn)。為了反應(yīng)更加充分，最終選擇以40 μL為信號(hào)標(biāo)記物的反應(yīng)體積。

在免疫測(cè)定中，減小標(biāo)記抗體的非特異性吸附是至關(guān)重要的，它往往制約了測(cè)定的檢測(cè)限。所以在本實(shí)驗(yàn)中，利用BSA封閉活性位點(diǎn)，從而防止假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果的產(chǎn)生。對(duì)BSA濃度的優(yōu)化如圖8-B所示。選取1%～10%的BSA并沒(méi)有目標(biāo)抗體PSA參與的情況下進(jìn)行考察。理論上，當(dāng)不存在抗原時(shí)，免疫反應(yīng)不能發(fā)生，無(wú)法形成“三明治”免疫夾心結(jié)構(gòu)，從而沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生。但從圖7-B中觀察到僅隨著B(niǎo)SA濃度的增加，信號(hào)逐漸減弱，直至BSA濃度為5%時(shí)，信號(hào)基本消失。因而，5%的BSA可以完全的封閉活性位點(diǎn)，達(dá)到最優(yōu)實(shí)驗(yàn)效果。

在“三明治”免疫反應(yīng)中，PSA抗原的孵化時(shí)間也極大的影響了免疫測(cè)定的性能。從圖8-C可以看出隨著孵育時(shí)間的增加，響應(yīng)信號(hào)也增加，40 min后趨于平穩(wěn)。考慮到更長(zhǎng)時(shí)間的孵育并不能顯著提高電流響應(yīng)，反而會(huì)增加非特異性吸附，所以實(shí)驗(yàn)中選用的孵育時(shí)間為40 min。

A:Volume of AuNPs@GSH-CdTe-Ab1；B:Concentration of BSA；C:Incubation time of PSA

3.6 雙重信號(hào)放大的免疫傳感分析性能

在上述最佳實(shí)驗(yàn)條件下，目標(biāo)抗原PSA的濃度與Cd2+溶出峰電流大小直接相關(guān)。如圖9-A，Cd2+溶出峰具有很好的峰型，并且隨著PSA濃度的增加而增大。從圖9-B可以看出，PSA質(zhì)量濃度在0.5～200 ng/mL PSA范圍內(nèi)，lgc(PSA)與溶出峰電流(I)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為I=-0.524 6 lgc-0.393 9，線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.997，檢測(cè)限為5.0 pg/mL。在相同條件下對(duì)10 ng/mL 的PSA進(jìn)行5次平行測(cè)定，得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.92%。以上可以證明該免疫傳感方法能對(duì)PSA實(shí)現(xiàn)靈敏準(zhǔn)確的測(cè)定。此外，與其他現(xiàn)有檢測(cè)PSA的方法比較，可以看出該方法具備更寬的線性范圍或更低的檢測(cè)限(表1)。

Figure9 Determination of PSA concentration by constructed immunoassay

Table1 Comparison of the present study and other reports for PSA detection

MethodLinear range/(ng/mL)LOD/(ng/mL)Ref.Chemiluminescence0.1-300.1[21]Electrochemiluminescence0.01-80.008[22]Colorimetric Immunoas-say0.05-200.03[23]Electrochemistry1-180.001[24]Fluorescence1.56-250.001 56[25]Electrochemistry0.5-2000.005This work

3.7 重復(fù)性、專屬性和穩(wěn)定性考察

考慮到該檢測(cè)方法的實(shí)用性，對(duì)所構(gòu)建的免疫傳感方法進(jìn)行了重復(fù)性、專屬性和穩(wěn)定性3個(gè)方面的考察。首先，重復(fù)性通過(guò)對(duì)3種檢測(cè)濃度5個(gè)不同批次的“三明治”免疫結(jié)構(gòu)進(jìn)行組間實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，組間實(shí)驗(yàn)的RSD在9%以內(nèi)，表明該免疫測(cè)定方法具有較好的重復(fù)性。

Table2 Reproducibility of this immunoassay were evaluated by inter-assay relative standard deviation (RSD)

c(PSA)/ (ng/mL)Current (×10-4 A)12345RSD/%1-0.402-0.426-0.386-0.388-0.4144.210-0.983-0.998-1.151-0.982-1.1558.6100-1.396-1.275-1.249-1.462-1.2138.0

其次，是專屬性的考察，實(shí)際樣品檢測(cè)中往往成分比較復(fù)雜，為了排除其他物質(zhì)對(duì)該方法的干擾，本實(shí)驗(yàn)選取甲胎蛋白(AFP)、組織多肽抗原(TPA)、癌胚抗原125(CA125)、人血清蛋白(HAS)作為干擾物，以50 ng/mL為基準(zhǔn)反應(yīng)濃度。最終結(jié)果可由圖10觀察得到，單一的干擾物的電流響應(yīng)值很小，并且各物質(zhì)與PSA的混合物對(duì)檢測(cè)的影響也可忽略，說(shuō)明該方法專屬性良好。

最后，將“三明治”免疫結(jié)構(gòu)在4 ℃下存放1個(gè)月，其電流響應(yīng)值為原始數(shù)值的89%，雖有少許降低，但也能看出該方法有較好的穩(wěn)定性。

Figure10 Selectivity of the PSA detection.The SWSVs of Cd2+responding to the different proteins (the concentration of AFP,TPA,CA125,HAS and PSA were 50 ng/mL) and the mixture of AFP,TPA,CA125,HAS and PSA is also 50 ng/mL.Error bars show the standard deviations of measurements taken from at least three independent experiments

3.8 實(shí)際樣品分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的實(shí)用性，采用加樣回收的方法對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行考察。將不同濃度的PSA加入到來(lái)自南京市鼓樓醫(yī)院的一系列血清樣品中，結(jié)果如表3所示，回收率在98.20%～106.2%之間，RSD均小于5%，表明該方法可用于實(shí)際樣品的測(cè)定。

Table3 Determination of PSA added in human blood serum (n=5) with the developed method

Serum sampleAdded PSA/(ng/mL)Found PSA/(ng/mL)RSD/%Recovery/%11.0000.9823.298.20210.009.9703.999.70350.0051.532.5103.14100.0106.24.1106.2

4 結(jié) 論

采用水熱法合成了GSH-CdTe QDs、AuNPs和rGO，并制備了相應(yīng)的復(fù)合物，利用AuNPs比表面積大以及較好的生物相容性，達(dá)到了成功裝載抗體以及放大信號(hào)的效果，同時(shí)具有較大表面積的rGO起到了協(xié)同放大的作用。因而在雙重信號(hào)放大的作用下，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)建的電化學(xué)免疫分析方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤標(biāo)志物PSA的檢測(cè)，具有較寬的線性范圍，并且該方法專屬性、重復(fù)性以及穩(wěn)定性好，可作為準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物PSA可行方法。