糖基化卵白蛋白肽的制備工藝優(yōu)化及特性與結(jié)構(gòu)分析

劉麗莉，李玉，楊陳柳，梁嚴予，代曉凝，孟園園，陳珂

(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽，471023)

卵白蛋白(ovalbumin，OVA)是蛋清蛋白的主要蛋白組分，其含量占蛋清蛋白總量的54%，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[1]。OVA的分子質(zhì)量為44.5 kDa，是典型的含磷球形的糖蛋白，其等電點為4.5，由385個氨基酸組成[2]。每1個OVA分子含有1個二硫鍵和4個巰基，是蛋清蛋白中唯一1個含有游離巰基的蛋白質(zhì)[3]。

蛋清粉具有便于運輸、易于貯藏等優(yōu)點，然而卻因其腥味重、黏度大、溶解性差等缺點嚴重限制了其在食品加工中的應(yīng)用。因此，采用適當?shù)姆椒▽Φ扒宸圻M行改性是亟待解決的問題。目前，國內(nèi)外學(xué)者采用各種方法對OVA進行改性以期改善其功能性質(zhì)[5-8]。目前，對于OVA的改性只研究了單一方法對其性質(zhì)的影響，而采用協(xié)同改性的方法對OVA進行改性卻未見報道。

酶法改性條件溫和，一般不會造成營養(yǎng)成分的損失，糖基化反應(yīng)可以提高產(chǎn)品風(fēng)味及功能性質(zhì)[9-10]。因此本文采用協(xié)同改性——酶法和糖基化相結(jié)合的方法對OVA進行改性，對OVA酶解物進行糖基化反應(yīng)，優(yōu)化糖基化反應(yīng)的工藝條件，并對協(xié)同改性前后產(chǎn)物的功能和結(jié)構(gòu)性質(zhì)進行研究，旨在為加工改性O(shè)VA在食品產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋購買于河南省洛陽市大商新瑪特超市。

葡聚糖T6 (5400-6600),上海藍季科技發(fā)展有限公司；甲醛,洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛,甘肅雙贏化工有限公司；硼砂、十二烷基磺酸鈉,天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；β-巰基乙醇,上海偉進生物科技有限公司；溴酚藍,天津市光復(fù)精細化工研究所；木瓜蛋白酶(酶活1 000 U/g),如吉生物科技有限公司；中性蛋白酶(酶活50 U/mg)，風(fēng)味蛋白酶(酶活20 000 U/g),上海藍季生物有限公司；溴化鉀(光譜純),鄭州市米萊化工產(chǎn)品有限公司；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-24DN垂直電泳槽、DYY-6C型穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀,上海博通化學(xué)科技有限公司；Alpha凝膠成像系統(tǒng),美國Protein Simple公司；高速冷凍離心機,美國Finnigan公司；真空冷凍干燥機,美國惠普公司；傅里葉變換紅外光譜儀,德國Bruck VERTEX70；日本電子掃描電鏡IT100,上海百賀儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 OVA肽及其糖基化產(chǎn)物制備

參照課題組以前的方法[11]制備OVA肽并作適當修改，稱取一定量OVA溶解于蒸餾水中，配制6%的蛋白溶液，采用m(木瓜蛋白酶)∶m(中性蛋白酶)∶m(風(fēng)味蛋白酶)=1∶1∶2的復(fù)合酶進行酶解，其酶解條件為加酶量7 500 U/g，pH 7.2，酶解溫度57.5 ℃，時間7.2 h。酶解結(jié)束后滅酶、離心，取上清液冷凍干燥，得到OVA酶解物即OVA肽。

稱取一定量的OVA肽，溶于一定量的去離子水中，按一定比例加入葡聚糖T6，充分攪拌溶解。調(diào)節(jié)溶液pH值，在適當溫度下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后立即置于冰浴冷卻至室溫。冷凍干燥后得到OVA肽糖基化產(chǎn)物。

1.3.2 接枝度的測定

根據(jù)JIANG[12]方法測定糖基化產(chǎn)物接枝度，取200 μL蛋白濃度為4 mg/mL的樣品液，加入4 mL OPA試劑，混勻后于35℃水浴鍋中反應(yīng)2 min，然后在340 nm處測吸光值?？瞻讓φ諡椋? mL OPA試劑和200 μL水。接枝度(DG)按下式計算。

(1)

式中：At為t時刻樣品的吸光度；A0為未反應(yīng)的吸光度。

1.3.3 褐變程度的測定

根據(jù)張蓓[13]方法測定褐變程度，取樣品液1 mL加入5 mL 0.1% SDS稀釋，0.1% SDS作為空白，在420 nm波長處測定其吸光值，即為褐變指數(shù)。

1.3.4 OVA肽糖基化反應(yīng)工藝條件優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗設(shè)計

分別以反應(yīng)溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)、pH值(6、7、8、9、10、11)、蛋白與糖的質(zhì)量比(4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)、蛋白質(zhì)量濃度(2、4、6、8、10、12 g/100 mL)及反應(yīng)時間(1、2、3、4、5、6 h)為單因素，考察各因素對接枝度及褐變程度的影響。

1.3.4.2 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以pH值、蛋白質(zhì)量濃度、OVA肽∶糖(質(zhì)量比)、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度5個因素為自變量，以接枝度(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計共36個試驗點的五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，因素水平見表1。

1.3.5 協(xié)同改性前后卵白蛋白功能特性的測定

1.3.5.1 乳化性能的測定

參照AGYARE等[15]的方法并作適當修改，將一定量的樣品蛋白溶解在pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，制成蛋白濃度為1 mg/ml的溶液。取20 mL蛋白溶液加入5 mL大豆油，10 000 r/min 均質(zhì)1 min，分別取均質(zhì)后0、10 min的最底層乳化液100 μL加入到100 mL 0.1%的SDS溶液中，用紫外分光光度計在500 nm波長處測定其吸光值，空白為0.1% SDS溶液。乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性(ESI)分別由式(2)、式(3)來計算：

表1 五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in second-ordel rotation combination experimental design

(2)

(3)

式中：A0、A10,乳濁液在0、10 min的吸光值；φ,油相體積分數(shù)(油的體積/乳濁液的體積);ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL;F,稀釋倍數(shù)。

1.3.5.2 起泡性能的測定

參照JING等[16]的方法測定蛋白質(zhì)的起泡性，將一定量的蛋白溶于pH 7.4 Tris-HCl緩沖液中，配制成蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，取50 mL蛋白溶液，記錄起始高度H0，10 000 r/min均質(zhì)2 min后記錄高度H1，靜置10 min后再次記錄高度H2。蛋白溶液起泡性(FAI)和泡沫穩(wěn)定性(FSI)的計算公式如下：

(4)

(5)

1.3.6 協(xié)同改性前后卵白蛋白的結(jié)構(gòu)分析

1.3.6.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測定

以分子質(zhì)量為6.5～200 kDa標準蛋白為對照，采用SDS-PAGE分析OVA、OVA肽、糖基化OVA肽的分子質(zhì)量變化，其中分離膠10%，濃縮膠5%。

1.3.6.2 傅里葉轉(zhuǎn)換紅外(FT-IR)分析

將冷凍干燥后的待測樣品與KBr按1∶100的質(zhì)量比混合，置于瑪瑙研缽中研磨至粉末狀，將樣品置于樣品槽中，在壓力10～15 MPa下壓片，1 min后將樣品取出，放入樣品室，采用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1波長區(qū)間對樣品進行掃描。

1.3.6.3 掃描電鏡(SEM)分析

將待測樣品用導(dǎo)電膠帶固定于樣品臺上，采用離子濺射儀進行噴金，抽真空1 h左右，在掃描電子顯微鏡下觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復(fù)3次，取其平均值。通過Origin Pro 8.5軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用DPS V 7.0專業(yè)版進行顯著性分析，設(shè)計專家Design-Expert. 8.0.5程序，作響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果如圖1所示。

a-pH值對接枝度和褐變程度的影響;b-底物配比對接枝度和褐變程度的影響;c-蛋白質(zhì)量濃度對接枝度和褐變程度的影響;d-反應(yīng)時間對接枝度和褐變程度的影響;e-反應(yīng)溫度對接枝度和褐變程度的影響圖1 單因素試驗結(jié)果Fig.1 Results of single-factor experiments

接枝度表示糖基化反應(yīng)進行的程度，褐變程度則表示反應(yīng)混合物的顏色變化，糖基化反應(yīng)中希望減少有色物質(zhì)的生成，同時增加初級階段和中級階段產(chǎn)生的功能特性較好的無色物質(zhì)[17]。由圖1可知，隨著pH值的增大，接枝度增大；當pH值達到8時，接枝度達到最大，此后隨著pH值的增大，接枝度逐漸減小，而褐變程度隨著pH值的增大，逐漸增大，故選取最佳pH值為8(圖1-a)；隨著葡聚糖T6添加量的增加，接枝度先升高后下降，當OVA肽與葡聚糖T6的質(zhì)量比為1∶1時，接枝度最大，且褐變程度較適宜。所以選擇底物配比為1∶1(圖1-b)；隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，接枝度先上升后下降，褐變程度逐漸增大。因此，OVA肽的質(zhì)量濃度為8 g/100 mL較為適宜(圖1-c)；隨著反應(yīng)的進行，接枝度逐漸上升，當反應(yīng)4 h時接枝度達到最大，隨后開始下降；褐變程度呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，因此，反應(yīng)時間選擇4 h(圖1-d)；隨著糖基化反應(yīng)溫度的上升，接枝度逐漸增加，當溫度到達60 ℃時接枝度開始出現(xiàn)下降趨勢，褐變程度逐漸增加。所以選取60 ℃為最佳反應(yīng)溫度(圖1-e)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果分析

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗，結(jié)果見表2。

表2 五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Quadratic orthogonal rotary composite experimental design (in coded level of five variables) and experimental result (n=3)

續(xù)表2

試驗號X1X2X3X4X5接枝度/% 71-1-11125.7481-1-1-1-123.199-1111-132.5310-111-1133.2311-11-11125.7512-11-1-1-123.1013-1-111127.0414-1-11-1-120.4215-1-1-11-124.2316-1-1-1-1119.6717-2000024.68 182000027.87 190-200021.37 200200027.37 2100-20020.15220020026.81 23000-2026.21 240002030.70 250000-229.08 260000226.50 270000037.10280000036.94290000034.19300000038.14310000032.21320000032.81330000033.81340000038.27350000036.58360000035.40

2.2.1 回歸模型方差分析和顯著性檢驗

采用Design-Expert. 8.0.5統(tǒng)計分析軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

表3 試驗結(jié)果方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression model equation

續(xù)表3

變異來源平方和自由度均方F值p值顯著性X3X58.2118.211.560.230 5不顯著X4X53.5213.520.670.426 2不顯著X12123.851123.8523.570.000 2極顯著X22191.071191.0736.36<0.000 1極顯著X32227.451227.4543.28<0.000 1極顯著X4264.73164.7312.320.003 2極顯著X5280.75180.7515.370.001 4極顯著回歸1 059.712052.9910.08<0.000 1極顯著剩余78.83155.26失擬35.7765.961.250.367 9不顯著誤差43.0694.78總和1 138.5435

注：p<0.01影響極顯著；p<0.05影響顯著。

本試驗構(gòu)建的模型在α=0.05顯著水平下剔除不顯著水平后的回歸方程為：

Y=-2 846.281+52.730X2+123.730X3+61.895X4-9.850X1X3-1.134X1X5-7.869X12-2.444X22-42.657X32-5.689X42-0.254X52

2.2.2 構(gòu)建模型的等高線和響應(yīng)面分析

各因素交互作用對接枝度的影響如圖2所示。

a-pH與OVA肽∶糖(質(zhì)量比);b-pH與反應(yīng)溫度圖2 各因素交互作用對接枝度的影響Fig.2 Response surface and corresponding contour plots showing the effect of interaction of various factors on the grafting degree

由圖2-a可知，pH與OVA肽∶糖對接枝度的交互影響呈拋物線形，等高線呈橢球狀，說明pH與OVA肽∶糖對接枝度的交互作用對接枝度影響顯著。當pH在8.9～9.3，OVA肽∶糖(質(zhì)量比)為1∶1.45～1∶1.65時，兩者的交互作用最明顯，此時接枝度達到30%以上。低于此范圍時，接枝度隨pH與OVA肽∶糖水平的增加而增大；高于此范圍時，接枝度隨pH與OVA肽∶糖水平的增加而減小。

由圖2-b可知，pH與反應(yīng)溫度對接枝度的交互影響呈拋物線形，等高線呈橢球狀，說明pH與反應(yīng)溫度對接枝度的交互作用對接枝度影響顯著。當pH為8.7～9.5，反應(yīng)溫度為63～67 ℃時，兩者的交互作用最明顯，此時接枝度達到30%以上。

采用Design-Expert. 8.0.5分析，確定最佳糖基化改性條件為pH 9、蛋白質(zhì)量濃度8 g/100mL、OVA肽∶糖(質(zhì)量比)為1∶1.5、反應(yīng)時間4.5 h、反應(yīng)溫度65 ℃，此時最高接枝度為36.78%，通過驗證實驗接枝度的平均值為(35.67±0.74)%，與理論預(yù)測值誤差絕對值為3.02%，表明優(yōu)化的糖基化條件可信。

2.3 協(xié)同改性前后功能特性的變化

由表4可知，OVA肽較OVA乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性分別提高了28.88 m2/g，25.20%。這是因為酶解使得OVA的疏水基團增加，結(jié)合油滴的能力增強[18]，親水基團伸展到水相中，提高了OVA的乳化性和乳化穩(wěn)定性。協(xié)同改性后的OVA的乳化活性指數(shù)比OVA提高了51.20 m2/g，乳化穩(wěn)定性提高了38.14%。原因可能是糖基化反應(yīng)后使蛋白形成多聚物后，產(chǎn)生了許多支鏈基團，從而使蛋白質(zhì)的空間位阻增大[19]，同時糖基化反應(yīng)后生成的蛋白聚合物的黏彈性比未處理的OVA高。

表4 協(xié)同改性前后OVA的功能性質(zhì)Table 4 The functional properties of OVA before and after the synergistic modification

注：結(jié)果以平均值±標準差表示，同列字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

OVA肽和協(xié)同改性O(shè)VA的起泡性和泡沫穩(wěn)定性較未改性O(shè)VA都有明顯提高。原因可能是蛋白質(zhì)的溶解度與起泡性能呈正相關(guān)，酶解和協(xié)同改性均使OVA的溶解度得到提高，從而使得協(xié)同改性后OVA的起泡性提高。同時，OVA肽與葡聚糖進行糖基化反應(yīng)后，引入了多羥基，使得分子間的作用力增強，蛋白質(zhì)膜的厚度和硬度增加[20]，從而使協(xié)同改性O(shè)VA的泡沫穩(wěn)定性增強。

2.4 協(xié)同改性前后結(jié)構(gòu)性質(zhì)的分析

2.4.1 SDS-PAGE分析

OVA、OVA肽及糖基化OVA肽的SDS-PAGE電泳圖如圖3所示。

Marker-標準蛋白；1-OVA；2-OVA肽；3、4-糖基化OVA肽平行樣圖3 改性前后OVA SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of OVA before and after the modification

由圖3可知，1號泳道大部分條帶出現(xiàn)在45.0 kDa處，即為OVA。在66.4～97.2 kDa處出現(xiàn)了一條蛋白條帶，可能是未除去的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白[21]。2號泳道的電泳條帶相對于OVA來說，出現(xiàn)明顯下移，且條帶分散，說明蛋白分子在酶解作用下被降解為小分子肽，其分子質(zhì)量分布在14.3～29 kDa。3、4號泳道均為糖基化OVA肽，其條帶相對于OVA肽明顯上移至45.0～97.2 kDa，這表明葡聚糖連接到OVA肽上使其分子質(zhì)量增大[22]。

2.4.2 傅里葉紅外光譜分析

OVA、OVA肽及糖基化OVA肽的紅外光圖譜如圖4所示。

圖4 紅外光譜圖分析Fig.4 Analysis of fourier transform infrared spectrometer

2.4.3 掃描電鏡分析

a-OVA;b-OVA肽;c-糖基化OVA肽圖5 改性前后OVA的SEM圖Fig.5 Scanning electron micrographs of before and after Ovalbumin

分別將OVA、OVA肽及糖基化OVA肽置于掃描電鏡下，放大同樣倍數(shù)，結(jié)果如圖5所示。由圖中可以看出OVA為典型的球蛋白[25]，表面光滑，成顆粒狀，排列緊密，表面有明顯的孔洞和不規(guī)則的凹陷。酶解之后，表面不規(guī)則的凹陷消失，相對于OVA顆粒變小，分子間的聚集程度加深，成簇狀，排列更緊密。經(jīng)過酶解和糖基化處理后，體系的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，球狀完全變成片狀結(jié)構(gòu)，排列緊密，表面有不規(guī)則的凸起或凹陷，分子間的交聯(lián)程度較好。這說明酶解和糖基化協(xié)同改性使其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化。

3 結(jié)論

通過響應(yīng)面法對OVA肽糖基化改性的工藝條件進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為pH 9、蛋白質(zhì)量濃度8 g/100mL、OVA肽∶糖(質(zhì)量比)為1∶1.5、反應(yīng)時間4.5 h、反應(yīng)溫度65 ℃，在此條件下，糖基化接枝度為(35.67±0.74)%。對改性前后OVA的乳化性、起泡性進行了分析。結(jié)果表明，協(xié)同改性較單獨酶解明顯改善了OVA的功能特性，為改善OVA的功能性質(zhì)提供了一種有效的新方法。

對協(xié)同改性前后OVA進行了SDS-PAGE、紅外、掃描電鏡分析，結(jié)果表明協(xié)同改性使其分子質(zhì)量發(fā)生明顯變化，由原來的44.3 kDa變?yōu)?5.0～97.2 kDa；蛋白的二級結(jié)構(gòu)被破壞，葡聚糖連接到OVA肽上，部分吸收峰變強；協(xié)同改性使其微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，由原來球狀變成片狀結(jié)構(gòu)，排列更加緊密。