海藻酸鈉對乳清分離蛋白溶液穩(wěn)定性的影響

譚九銘，覃小麗，鐘金鋒，曾凡坤，崔夢楠

(西南大學 食品科學學院，食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，重慶，400715)

乳清分離蛋白是從牛奶中提取的一種蛋白質(zhì)產(chǎn)品，在食品工業(yè)中常用作乳化劑來制備乳液。其通過位阻作用和靜電力作用抑制液滴團聚，進而賦予乳狀液良好的穩(wěn)定性[1-3]。然而以乳清分離蛋白作為單一乳化劑時，其應用受環(huán)境因素(如pH值和離子強度)的影響較大。因此，提高乳清分離蛋白溶液在不同環(huán)境條件下的穩(wěn)定性，有助于進一步拓展乳清分離蛋白作為乳化劑的使用范圍。

目前對提高乳清分離蛋白溶液穩(wěn)定性的研究主要集中在利用蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈的氨基與多糖分子中還原末端的羥基間的美拉德反應生成共價復合物[4]，以及利用蛋白質(zhì)和多糖分子間的電荷相互作用、范德華力、疏水相互作用力、氫鍵和分子纏結(jié)相互作用形成非共價復合物，如乳清分離蛋白-果膠復合物[5]、乳清分離蛋白-阿拉伯樹膠復合物[6]、乳清分離蛋白-魚膠復合物等[7]。然而，在提高乳清分離蛋白溶液穩(wěn)定性的研究中加入海藻酸鈉尚未見報道。海藻酸鈉主要從海帶、褐藻中分離得到，是一種由α-L古羅糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸連接起來的陰離子線性多糖。它能夠改善蛋白質(zhì)的界面吸附性能、界面吸附膜的流變學性能、連續(xù)相的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而提高蛋白質(zhì)體系的穩(wěn)定性[8]，同時還具有無毒、較好的生物相容性、價格較低廉等特點。因此通過添加海藻酸鈉來改善乳清分離蛋白溶液的穩(wěn)定性，有望獲得一種新型的穩(wěn)定的乳清分離蛋白復合溶液。但海藻酸鈉的添加量、環(huán)境因素(如pH值、離子強度)對乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的影響尚不清楚[9]。因此，研究海藻酸鈉添加量對復合溶液的影響，并分析乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液在環(huán)境因素(如pH值、離子強度)影響下的變化規(guī)律，以期明確穩(wěn)定的乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的形成條件，為進一步擴大乳清分離蛋白和海藻酸鈉在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應用范圍提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白、海藻酸鈉、NaOH、HCl、NaCl、1,2-丙二醇(分析純)，四川省成都市科龍化工試劑廠；尼羅藍-A，上海Sigma公司。

1.2 實驗儀器

電子天平(FB224型)，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；頂置式機械攪拌器(RW20型)，德國IKA集團；高速分散機(T18型)，德國IKA集團；納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasize Nano ZS90型)，英國Malvern公司；生物顯微鏡(N-300M型)，日本奧林巴斯公司；紫外可見分光光度計(UV-2450型)，日本島津公司；熒光顯微鏡(IX71型)，日本奧林巴斯公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的制備

稱取0.3 g的乳清分離蛋白，溶解于60.0 mL去離子水中，攪拌30 min(30 ℃，500 r/min)。然后，將其置于4 ℃的冰箱中過夜，使蛋白質(zhì)充分水化。次日，稱取0～0.3 g的海藻酸鈉粉末，溶于40.0 mL去離子水中，然后將蛋白溶液和海藻酸鈉溶液充分混合(700 r/min)。接著，采用高速分散機均質(zhì)3 min(10 000 r/min)，獲得乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液。用0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液至所需pH值，在所需的pH值下平衡1～3 min。在25 ℃條件下貯藏24 h后，考察海藻酸鈉的添加量、pH值對乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的ζ-電位、粒徑、濁度和微觀結(jié)構(gòu)的影響。此外，在確定乳清分離蛋白與海藻酸鈉最適比例的基礎(chǔ)上，進一步考察離子強度(NaCl濃度為0～0.2 mol/L)對不同pH值的復合溶液的影響。

1.3.2 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液濁度的測定

采用濁度法測定乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的濁度[10]。將復合溶液稀釋200倍，以去離子水作為參照物，測定600 nm波長處樣品的吸光度值。蛋白質(zhì)-多糖復合溶液的濁度按式(1)計算：

(1)

式中：L，比色皿的寬度，1 cm；N，稀釋倍數(shù)，200。

1.3.3 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液粒徑測定

通過Zetasize Nano ZS90測定復合溶液粒徑的大小。測定前，將復合溶液用去離子水稀釋2 000倍，將折射率設置為1.330，平衡時間為120 s，每個樣品平行測試3次。

1.3.4 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液ζ-電位的測定

乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液ζ-電位 (Zeta電位) 的測定利用Zetasize Nano ZS90測定。將平衡時間設定為120 s，每個樣品平行測定3次。

1.3.5 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將2 μL的樣品滴在載玻片上，蓋好蓋玻片。使用N-300M型生物顯微鏡在40倍視野下觀察樣品并拍照。

1.3.6 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液熒光染色的觀察

采用熒光顯微鏡觀察乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液中蛋白質(zhì)的分布情況。將尼羅藍充分溶解于1,2-丙二醇水溶液[V(1,2-丙二醇)∶V(水)=50∶1)]中，制成1.0 g/L尼羅藍染色劑。將1 mL樣品與42 μL染色劑充分混合，避光保存15 min。觀測前，將1滴樣品滴在載玻片上，然后慢慢蓋上蓋玻片，該過程需要防止氣泡產(chǎn)生，平衡2 min后，將樣品放置于載物臺上，用40倍的物鏡觀察樣品，拍攝熒光圖像。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每個實驗至少重復2次，結(jié)果以平均值±標準偏差表示。所有數(shù)據(jù)用OriginPro 8.1軟件統(tǒng)計分析并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液ζ-電位的影響

不同pH條件下，海藻酸鈉添加量對復合溶液ζ-電位的影響如圖1所示。隨著溶液pH值增加，乳清分離蛋白溶液(海藻酸鈉添加量為0)的ζ-電位從18.7 mV降低至-25 mV；當溶液pH值約為5時，該溶液的ζ-電位接近零，說明乳清分離蛋白的等電點為pH 5左右。添加海藻酸鈉后，復合溶液的ζ-電位值在低pH值范圍內(nèi)(pH=2～4)明顯降低。這與帶正電的乳清分離蛋白和帶負電的海藻酸鈉之間強烈的靜電吸引有關(guān)[11]。在較高pH值范圍內(nèi)(pH=5～7)，復合溶液的ζ-電位值變化幅度相對較小。這是因為此時蛋白質(zhì)帶負電，其表面只有某區(qū)域、某片段仍帶有部分正電荷，故陰離子多糖只能通過局部靜電吸引作用吸附到蛋白質(zhì)的表面，形成弱可逆的靜電復合物，使復合溶液的ζ-電位值降低幅度不大[12]。

隨著海藻酸鈉添加量增加，復合溶液的ζ-電位值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。這是由于海藻酸鈉帶負電，加入后與乳清分離蛋白結(jié)合形成低ζ-電位的復合物使得復合溶液的ζ-電位降低。正是由于復合溶液的ζ-電位值減小但絕對值增大，使得靜電排斥作用加強，溶液的穩(wěn)定性才得以維持。類似的，QIU等[13]研究球蛋白和小麥多糖、果膠復合時也得到了相同的結(jié)論。當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))≥0.25%時，復合溶液的ζ-電位值基本保持不變，表明蛋白質(zhì)上的吸附位點已完全被海藻酸鈉分子覆蓋，多余的海藻酸鈉分子無法再繼續(xù)吸附到蛋白質(zhì)表面[14]。綜上所述，一定含量的海藻酸鈉可增強復合物之間的靜電排斥力，且在低pH值范圍內(nèi)影響更為顯著。

圖1 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液ζ-電位的影響Fig.1 Influence of sodium alginate on ζ-potential of whey protein-based solution with different pH

2.2 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液粒徑的影響

不同pH條件下，海藻酸鈉添加量對復合溶液粒徑的影響如圖2所示。隨溶液pH值增加，乳清分離蛋白溶液的粒徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當溶液pH值約為5時，溶液平均粒徑達到了最大值，這主要由于該pH值接近乳清分離蛋白等電點，分子間排斥力降低甚至消失，乳清分離蛋白在范德華力等相互作用的影響下聚結(jié)或絮凝而導致粒徑值增大[15]。添加海藻酸鈉后，復合溶液的粒徑隨pH值的變化趨勢與乳清分離蛋白溶液的變化趨勢類似，但是變化幅度減小。這是因為乳清分離蛋白和海藻酸鈉通過靜電吸附作用形成的蛋白質(zhì)-多糖復合物能夠構(gòu)造出一個緊密、厚重的保護層，使復合物表面的電荷密度增加，靜電排斥作用和空間位阻效應更加顯著[16]。因此，pH值變化對復合溶液的影響比乳清分離蛋白溶液要小。

當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))≤0.15%時，隨海藻酸鈉添加量增加，復合溶液的粒徑有增大的趨勢。CHO等[17]提出這可能是因為多糖的濃度過低以致不能夠完全覆蓋蛋白質(zhì)的表面時，一個多糖分子會與多個蛋白質(zhì)分子相互吸附，此時蛋白質(zhì)的絮凝速度要比多糖覆蓋到蛋白質(zhì)表面的速度快，產(chǎn)生橋聯(lián)絮凝，使粒徑增大。海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))>0.15%時，則會有足夠的多糖吸附在蛋白質(zhì)表面，將蛋白質(zhì)緊緊包裹，防止多個蛋白質(zhì)分子相互連接，形成水溶性蛋白質(zhì)-多糖靜電復合物。這種復合物使得靜電斥力作用、空間位阻等效應增強，抑制體系中的分子聚集，從而減小粒徑，提高體系的穩(wěn)定性[18]。當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.20%～0.30%時，復合溶液的粒徑值變化不大，這提示過量海藻酸鈉并未使復合溶液發(fā)生空缺絮凝[19]。

圖2 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液粒徑的影響Fig.2 Influence of sodium alginate on the particle size of whey protein-based solution with different pH

2.3 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液濁度的影響

不同pH條件下，海藻酸鈉添加量對復合溶液濁度的影響如圖3所示。隨溶液pH值增加，乳清分離蛋白溶液的濁度呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當pH值約為5時，濁度達到了最大值，預示著在等電點附近不溶性復合物的形成。添加海藻酸鈉后，復合溶液的濁度隨pH值的變化趨勢與乳清分離蛋白溶液的變化趨勢類似，但是變化幅度減小。這表明此時乳清分離蛋白和海藻酸鈉通過靜電吸附作用形成了光密度相對較低、相對穩(wěn)定的可溶性復合物。基于這些結(jié)果，復合溶液濁度的變化與其粒徑的變化趨勢相似，是溶液粒徑變化的表觀體現(xiàn)。

圖3 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液濁度的影響Fig.3 Influence of sodium alginate on turbidity of whey protein-based solution with different pH

當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))≤0.15%時，隨海藻酸鈉添加量增加，復合溶液的濁度有增大的趨勢。這可能是因為橋聯(lián)絮凝作用使得可溶性復合物聚集絮凝，濁度增大[17]。當海藻酸鈉的添加量繼續(xù)增加，復合溶液的濁度則出現(xiàn)減小的趨勢，這可能是因為溶液中充足的海藻酸鈉抑制了橋聯(lián)絮凝作用的發(fā)生，形成相對穩(wěn)定的可溶性復合物。這些結(jié)果與HARNSILAWAT等[20]研究殼聚糖包埋β-乳球蛋白時得到的結(jié)果一致。ZHANG等[21]的研究也表明，向溶液中加入適量多糖，可提高蛋白質(zhì)在水中的分散性，使溶液的濁度降低。當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.20%～0.30%時，復合溶液的濁度值均較小且變化不大。

2.4 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液微觀結(jié)構(gòu)的影響

不同pH條件下，海藻酸鈉添加量對復合溶液微觀結(jié)構(gòu)的影響如圖4所示。隨pH值增加，溶液在pH值為4和5時均出現(xiàn)明顯的絮狀聚集物，呈現(xiàn)綿絲結(jié)構(gòu)，微觀結(jié)構(gòu)混亂、無序。這是由于此時溶液的pH值靠近蛋白質(zhì)的等電點，體系中的分子易發(fā)生聚集和交聯(lián)。當溶液的pH值遠離等電點時，由于靜電排斥力重新占據(jù)主導地位，不易發(fā)生聚集和交聯(lián)，體系恢復均勻、有序的狀態(tài)。

圖4 海藻酸鈉添加量對不同pH的復合溶液微觀結(jié)構(gòu)的影響(×40)Fig.4 Influence of sodium alginate on microstructure of whey protein-based solution with different pH (×40)

當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))≤0.15%時，隨海藻酸鈉添加量增加，復合溶液的微觀結(jié)構(gòu)由較為均勻、有序逐漸變?yōu)榛靵y、無序，與復合溶液粒徑的變化趨勢一致。這可能是因為橋聯(lián)絮凝作用使得聚集物形成，從而使復合溶液微觀結(jié)構(gòu)變得混亂無序。當海藻酸鈉的添加量>0.15%時，添加海藻酸鈉的復合溶液中絮狀聚集物明顯減少，同時聚集物的平均直徑更小，更為均一。當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.25%和0.30%時，復合溶液微觀結(jié)構(gòu)較為均勻、有序，沒有明顯的聚集物形成。這表明一定含量的海藻酸鈉可使復合溶液形成均勻、有序的結(jié)構(gòu)，提高體系的穩(wěn)定性。基于以上的數(shù)據(jù)綜合考慮，當海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.25%和0.30%時，復合溶液的ζ-電位、粒徑、濁度和微觀結(jié)構(gòu)均較為合適，但海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.25%時更為經(jīng)濟節(jié)約。因此，當乳清分離蛋白的質(zhì)量分數(shù)為0.30%時，海藻酸鈉的最佳添加量(質(zhì)量分數(shù))為0.25%(最佳的制備質(zhì)量比為3∶2.5)。

2.5 離子強度和pH值對復合溶液穩(wěn)定性的影響

基于上述結(jié)果，當乳清分離蛋白和海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))分別為0.30%時和0.20%時，復合溶液的ζ-電位絕對值較大，粒徑和濁度較小，溶液的微觀結(jié)構(gòu)較均勻，因此該復合溶液較穩(wěn)定。除了復合溶液的制備參數(shù)外，環(huán)境因素(如離子強度和pH值)也會影響復合溶液的穩(wěn)定性。因此，研究離子強度和pH值對復合溶液的影響規(guī)律，為復合溶液在食品加工中的使用提供借鑒。由圖5可知，隨著NaCl濃度增大，復合溶液ζ-電位的絕對值減小。這是因為離子強度對復合溶液的影響主要是通過Na+和乳清分離蛋白的正電荷基團氨基競爭與海藻酸鈉的羧基結(jié)合，Cl-和海藻酸鈉的負電荷基團羧基競爭與乳清分離蛋白的氨基結(jié)合而實現(xiàn)的。這使得乳清分離蛋白和海藻酸鈉所帶靜電荷減少，復合溶液ζ-電位的絕對值減小[22]。而隨pH值的減小，復合溶液ζ-電位的絕對值也減小。這是因為pH值的降低，使得乳清分離蛋白帶正電荷，從而使復合溶液ζ-電位的絕對值減小。當pH值為7時，復合溶液ζ-電位的絕對值最大，有利于復合溶液的穩(wěn)定。

圖5 NaCl濃度、溶液pH值對乳清分離蛋白(0.3%)和海藻酸鈉(0.2%)復合溶液ζ-電位的影響Fig.5 Influence of NaCl concentration and pH on the zeta-potential of whey protein-based solution

由圖6可知，復合溶液的粒徑隨著NaCl濃度的增大而增大。這可能是因為NaCl的加入使乳清分離蛋白或海藻酸鈉的表面不斷積累帶相反電荷的離子，這些離子影響了蛋白質(zhì)或多糖自身電荷的暴露，導致靜電相互作用下降，不利于靜電復合物的形成，并進一步推動復合物間的絮凝作用，因此復合溶液的粒徑隨NaCl濃度的增大而增大[23]。當pH值接近乳清分離蛋白等電點(約pH=5)時，復合溶液的粒徑明顯增大。這可能是因為在接近等電點條件下，乳清分離蛋白所帶正電荷較少，與陰離子多糖的吸附作用弱，不利于復合物的形成，使得NaCl對復合溶液的影響更加顯著[24]。

圖6 NaCl濃度、溶液pH值對乳清分離蛋白(0.3%)和海藻酸鈉(0.2%)復合溶液粒徑的影響Fig.6 Influence of NaCl concentration and pH on the particle size of whey protein-based solution

如圖7所示，隨NaCl濃度的增大，復合溶液的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出不均一的片狀和顆粒狀聚集物。這可能是因為高濃度NaCl的存在，產(chǎn)生了靜電屏蔽作用，從而使得溶液中復合物間的靜電排斥作用減弱，復合物相互吸引而聚集絮凝，形成了不均一的片狀和顆粒狀聚集物。當溶液pH值接近乳清分離蛋白等電點時，復合溶液的微觀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出明顯的聚集物。綜上，當NaCl濃度為0.20 mol/L時對復合溶液的影響較大，此時復合溶液的ζ-電位絕對值明顯減小、粒徑增大、微觀結(jié)構(gòu)混亂無序。當復合溶液的pH值為2和7時，復合溶液的粒徑和微觀結(jié)構(gòu)受NaCl的影響較小。

圖7 不同NaCl濃度、溶液pH值下乳清分離蛋白(0.3%)和海藻酸鈉(0.2%)復合溶液的顯微鏡成像(×40)Fig.7 Influence of NaCl concentration and pH on microstru-cture of whey protein-based solution (×40)

2.6 乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液熒光顯微分析

基于上述分析，當乳清分離蛋白和海藻酸鈉的添加量(質(zhì)量分數(shù))分別為0.30%和0.25%時，復合溶液的ζ-電位絕對值較大，粒徑和濁度較小，溶液的微觀結(jié)構(gòu)較均勻。熒光顯微常用于溶液組分微觀結(jié)構(gòu)的研究，其能夠直觀地反映出溶液粒徑大小、分散狀況及產(chǎn)生的不穩(wěn)定現(xiàn)象。圖8反映了加入海藻酸鈉前后，溶液微觀結(jié)構(gòu)的變化。在熒光顯微鏡圖像中蛋白質(zhì)被尼羅藍染色而呈現(xiàn)紅色。當溶液pH值為5時，溶液中有明顯呈現(xiàn)片狀和顆粒狀結(jié)構(gòu)的紅點出現(xiàn)。當溶液的pH值遠離等電點(pH=2)時，由于靜電排斥力增大，聚集物的數(shù)量明顯減少、粒徑明顯減小。這說明一定量的海藻酸鈉有利于乳清分離蛋白形成形成均勻復合溶液，從而得到均一、穩(wěn)定性較好的溶液，這與上述溶液的粒徑變化和光學顯微鏡觀察結(jié)果一致。

圖8 海藻酸鈉添加量對不同pH的乳清分離蛋白(0.3%)復合溶液熒光圖像的影響(×40)Fig.8 Influence of sodium alginate on fluorescence image of whey protein-based solution with different pH (×40)注：部分紅點已用箭頭指示。

圖9為加入NaCl前后，溶液微觀結(jié)構(gòu)的變化。由圖9可知，溶液pH值為5時，加入NaCl后，圖像出現(xiàn)了較多的紅色。這表明隨著NaCl的加入，溶液的穩(wěn)定性受到了一定的影響，發(fā)生了絮凝、聚結(jié)。當復合溶液的pH值遠離等電點(pH=2)時，復合溶液的微觀形態(tài)受NaCl的影響則相對較小。

3 結(jié)論

圖9 不同NaCl濃度、溶液pH值下乳清分離蛋白(0.3%)和海藻酸鈉(0.25%)復合溶液的熒光顯微鏡成像(×40)Fig.9 Influence of NaCl concentration and pH on fluorescence microstructure of whey protein-based solution (×40)注：部分紅點已用箭頭指示。

當海藻酸鈉含量(質(zhì)量分數(shù))較低(≤0.15%)時，復合溶液的粒徑和濁度隨著海藻酸鈉添加量的增大而增大，微觀結(jié)構(gòu)混亂無序，使得復合溶液穩(wěn)定性降低；當海藻酸鈉含量較高(0.20%～0.30%)時，復合溶液的ζ-電位絕對值較大，粒徑和濁度較小，溶液的微觀結(jié)構(gòu)均勻有序，復合溶液穩(wěn)定性較高。同時與乳清分離蛋白溶液相比，添加了海藻酸鈉的復合溶液的粒徑、濁度與生物顯微鏡和熒光顯微鏡下的微觀結(jié)構(gòu)混亂無序的程度隨pH值的增加而先增大后減小，但變化的幅度更小。當海藻酸鈉的含量為0.25%(乳清分離蛋白和海藻酸鈉的質(zhì)量比為3∶2.5)時，復合溶液較為穩(wěn)定，且原料成本最為經(jīng)濟。此外，NaCl濃度的增加會使乳清分離蛋白與海藻酸鈉之間的靜電相互作用變?nèi)?，破壞溶液穩(wěn)定性。當NaCl濃度為0.20 mol/L時對復合溶液的影響較大，此時復合溶液的ζ-電位絕對值明顯減小、粒徑增大、生物顯微鏡和熒光顯微鏡觀察到的微觀結(jié)構(gòu)混亂無序。當pH值接近乳清分離蛋白等電點(約pH=5)時，添加了NaCl的復合溶液的粒徑明顯增大，微觀結(jié)構(gòu)最為混亂無序。但在遠離等電點的pH值條件下離子強度的增加對復合溶液的影響仍較小。綜上所述，添加適量的海藻酸鈉可改善乳清分離蛋白-海藻酸鈉復合溶液的穩(wěn)定性。