枯草芽孢桿菌菌株B3抗菌肽的分離純化與鑒定

白杰，贠建民*，祝發(fā)明，嚴(yán)海嬌，張紊瑋，艾對(duì)元

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070) 2(甘肅省生物抗菌肽工程技術(shù)研究中心，甘肅 張掖，734000)

抗菌肽(antibacterial peptides)又稱(chēng)抗微生物肽(antimicrobial peptides，AMPs)，是生物體在抵抗病原微生物的防御反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)具有抗微生物活性的小分子多肽。目前，在不同動(dòng)、植物組織和微生物中都已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并被證實(shí)有抗菌作用的蛋白質(zhì)和多肽也是其先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分[1]。這些抗菌肽具有抗菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、種類(lèi)多、可供選擇范圍廣、靶菌株不易產(chǎn)生抗性突變等特點(diǎn)，同時(shí)鑒于許多微生物已對(duì)抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此，抗菌肽預(yù)計(jì)將成為新一代的臨床抗菌藥物，并且在化妝品、生物農(nóng)藥、動(dòng)物飼料添加劑、天然食品防腐劑、動(dòng)植物抗病基因工程等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。

自1972年，瑞典的科學(xué)家BOMAN等人首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)抗菌肽及其免疫功能方面的活性以來(lái)，直到1981年《Nature》雜志上公布的來(lái)自STEINER等人發(fā)現(xiàn)的CecropinA、B的氨基酸序列被認(rèn)為是第一個(gè)真正意義上的抗菌肽[4]。在此后多年時(shí)間里，人們相繼從微生物和動(dòng)植物甚至人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)、分離獲得了多種具有抗菌能力的活性多肽。BAGHIAN等研究發(fā)現(xiàn)，用與蜂毒素類(lèi)似的合成物與疙疹病毒(HSV-1)作用時(shí)，能抑制HSV-1感染細(xì)胞的破裂和病毒擴(kuò)散，蜂毒素的存在不僅能夠影響糖蛋白的合成，還可通過(guò)調(diào)整細(xì)胞Na+/K+泵而保護(hù)細(xì)胞從而阻止了細(xì)胞的裂解，因而對(duì)宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成和生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生影響[5-6]。STEIN發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)具有產(chǎn)生二十多種結(jié)構(gòu)多樣化抗菌化合物的潛力[7]，在這些抗微生物化合物中，表面活性素和神經(jīng)蛋白的環(huán)狀脂肽等在生物技術(shù)和生物制藥應(yīng)用中具有廣泛認(rèn)可的潛在用途[8-9]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的Cereopin A，Myfimycin，Thanafin和Drosomycin等生物活性小肽都具有抗真菌的作用[10-11]。近年來(lái)，張東玲等人在研究針對(duì)單一抗菌肽用不同層析柱分離純化中發(fā)現(xiàn)凝膠過(guò)濾層析柱與反相液相層析柱的聯(lián)用改善日本鰻鱺肝臟抗菌肽分離純化效果良好，洗脫峰數(shù)量較多，峰形單一且尖銳狹窄，基線(xiàn)平而低[12]。喻鋼等人建立了基于制備型反相色譜柱分離純化枯草芽孢桿菌細(xì)菌素類(lèi)抗菌活性物質(zhì)方法[13]。目前抗菌肽的分離純化方案大多是基于抗菌肽分子量較小、帶正電荷和兩親性等特性，采用多級(jí)純化手段[14]。盡管抗菌肽具有巨大開(kāi)發(fā)潛力，但對(duì)其結(jié)構(gòu)信息與活性功能之間的關(guān)系還不甚了解[15]，建立高效的抗菌肽分離、純化和檢測(cè)方法是開(kāi)展相關(guān)理論研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)。

本研究以枯草芽孢桿菌B3菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物為樣品，擬采用串聯(lián)層析系統(tǒng)，通過(guò)由陽(yáng)離子交換層析、疏水層析和尺寸排阻層析3種層析組成的層析系統(tǒng)，根據(jù)發(fā)酵液中目的抗菌肽與雜蛋白具有電荷差異、疏水差異、分子大小差異的原理，分別去除其他物質(zhì)從而達(dá)到純化的效果。并將經(jīng)串聯(lián)層析系統(tǒng)和反向色譜技術(shù)純化后的抗菌肽，通過(guò)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析對(duì)得到具有抑菌活性的小分子多肽進(jìn)行分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)信息分析，旨在為獲得抗菌肽純品及其結(jié)構(gòu)信息，并為抗菌肽制備及抗菌肽制品檢測(cè)提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 靶標(biāo)菌株

大腸桿菌(CGMCC10003)和沙門(mén)氏桿菌(CGMCC10467)，由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 拮抗菌株

本實(shí)驗(yàn)室前期從甘肅河西鹽堿土壤中分離獲得1株對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)和沙門(mén)氏桿菌(Salmonellaentericasubsp.enterica)具有拮抗作用的細(xì)菌菌株B3，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌B3(BacillussubtilisB3)。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基：參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中培養(yǎng)基配方配制。

1.1.4 試劑

Capto S離子交換層析介質(zhì)，GE Healthcare有限公司；苯基-瓊脂糖凝膠，北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-100凝膠柱，上海玉博生物科技有限公司(Pharmacia)；氨芐青霉素，上海莼試生物技術(shù)有限公司；NaCl、KH2PO4、K2HPO4，天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉，北京蘭博利德商貿(mào)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HL-2恒流泵，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；離心機(jī)，德國(guó)Sigma實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司； DHP-9012電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海立久自動(dòng)化設(shè)備有限公司；潔凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LDZX-50KBS立式壓力滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；101型鼓風(fēng)干燥箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，上海比朗儀器制造有限公司；反向高效液相色譜儀(WATERS 2695型)、反射式基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜( USA ABI-4800型)、UV-5800PC紫外分光光度計(jì)，上海華錫生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌粗提物的制備

從甘肅河西鹽堿土壤中發(fā)現(xiàn)1株對(duì)大腸桿菌(E.coli)和沙門(mén)氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)具有抑菌作用的枯草芽孢桿菌B3菌株(BacillussubtilisB3)，將該枯草芽孢桿菌B3菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，11 000 r/min離心20 min收集上清液，得到的上清液即為抗菌粗提物。

1.3.2 抗菌活性物質(zhì)的分離純化

1.3.2.1 陽(yáng)離子交換層析

采用Capto S陽(yáng)離子柱對(duì)上述抗菌粗提物進(jìn)行層析。用0.02 mol/L, pH 5.8的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將抗菌粗提物以2 BV/h的速度上樣，隨后以0.03～0.12 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫，每5 min收集1次洗脫液，分別用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)280 nm處測(cè)其吸光度，繪制吸光值曲線(xiàn)圖[16]，并采用1.3.5方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線(xiàn)圖[17]。

1.3.2.2 疏水層析

以苯基-瓊脂糖凝膠作為疏水介質(zhì)對(duì)上述1.3.2.1收集的洗脫液進(jìn)行疏水層析，其中采用0.02 mol/L、pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2 BV/h的速度上樣，隨后依次用0.05、0.04、0.03、0.02、0.01 mol/L的pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行梯度洗脫，每5 min收集1次洗脫液，繪制吸光度曲線(xiàn)，評(píng)價(jià)分離效果，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線(xiàn)圖[18-19]。

1.3.2.3 尺寸排阻層析

以Sephadex G-100凝膠柱對(duì)有抑菌活性的組分進(jìn)行純化，其中采用0.02mol/L，pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液平衡后，以2 BV/h的速度上樣，隨后以pH 5.8的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行洗脫，每5 min收集1次洗脫液，繪制吸光度曲線(xiàn)，評(píng)價(jià)分離效果，并進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，收集具有抑菌圈的洗脫液，繪制抑菌直徑曲線(xiàn)圖[20]。

將上述逐步層析后的具有抑菌活性的洗脫液，進(jìn)行冷凍干燥，得到的即為抗菌肽，-20 ℃保存，備用。

1.3.3 反相HPLC分離純化抗菌物質(zhì)[21-22]

①樣品處理: 將經(jīng)過(guò)串聯(lián)層析系統(tǒng)純化后的半純品溶于雙蒸水中，溶液濃度為300 mg/mL，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。②色譜條件：ZORBAX 300 StableBond (300SB) C8色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) 流動(dòng)相A：0.1%的三氟乙酸水溶液；流動(dòng)相B：80%的乙腈水溶液；柱溫：25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；最大壓力：200 bar；時(shí)間：65 min；流速：0.700 mL/min；上樣量：20 μg。收集各個(gè)峰樣品，冷凍干燥。以沙門(mén)氏菌作為指示菌，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各個(gè)峰的活性。

1.3.4 B3抗菌物質(zhì)的基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS分)析

收集反相HPLC分離純化得到的活性峰，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)質(zhì)譜分析，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和比對(duì)。質(zhì)譜檢測(cè)條件：鞘氣體流量15 arb，輔助氣體流量5 arb，熱噴涂電壓4.7 kV，毛細(xì)管溫度 275 ℃，毛細(xì)管電壓49 V，套管透鏡補(bǔ)償電壓 120 V。

1.3.5 抑菌活性檢測(cè)[23]

采用雙層瓊脂孔穴擴(kuò)散法并稍作改動(dòng)。以大腸桿菌(CGMCC10003)和沙門(mén)氏桿菌(CGMCC10467)為靶標(biāo)菌。將大腸桿菌和沙門(mén)氏桿菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基與營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃振蕩培養(yǎng)15 h，備用。將加熱融化的LB固體培養(yǎng)基15 mL注入到無(wú)菌平皿中待凝固后形成底層并放置牛津杯，吸取靶標(biāo)菌液各100 μL，分別加入裝有未凝固且不燙手的LB固體培養(yǎng)基三角瓶中，混勻，傾注30 mL到平皿中待凝固后形成上層，凝固后取出牛津杯形成有孔穴的培養(yǎng)平板，然后在培養(yǎng)基已形成的孔洞里加入200 μL的待檢樣液，并做陰性、陽(yáng)性對(duì)照。其中陰性對(duì)照為緩沖液，陽(yáng)性對(duì)照為質(zhì)量濃度100 μg/mL的氨芐青霉素溶液。置于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 h，觀(guān)察抑菌效果，測(cè)量抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.6 抗菌肽的理化性質(zhì)

1.3.6.1 最小抑菌質(zhì)量濃度測(cè)定

將定量由上述方法純化后的樣品做2倍遞減質(zhì)量濃度稀釋?zhuān)謩e為0.010 156、0.020 312、0.040 625、0.081 25、0.162 5、0.325、0.65、1.3 μg/mL，對(duì)2株靶標(biāo)菌分別做抑菌試驗(yàn)，以抑菌圈直徑在10 mm以上作為依據(jù)來(lái)確定最小抑菌質(zhì)量濃度。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值[24]。

1.3.6.2 耐熱性檢測(cè)

將定量由上述方法純化后的樣品配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在40、50、60、80、90、100、110、120 ℃下分別加熱30 min，對(duì)2株靶標(biāo)菌分別做抑菌試驗(yàn)，以未經(jīng)加熱的純化樣品為對(duì)照，觀(guān)察抑菌圈直徑變化[25]。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.6.3 耐酸堿度檢測(cè)

將定量由上述方法純化后的樣品配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，分別調(diào)pH值至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，放置10 min，對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏桿菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察抑菌圈直徑變化，以pH 5.8的純化樣品為對(duì)照[26-27]。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.6.4 光照穩(wěn)定性檢測(cè)

將定量由上述方法純化后的樣品配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，在日光燈下放置10 min、30 min、1 h、6 h、24 h、48 h，對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)氏桿菌做抑菌實(shí)驗(yàn)，觀(guān)察抑菌圈直徑變化，以未經(jīng)日光燈照射的純化樣品為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 串聯(lián)柱層析系統(tǒng)分離結(jié)果

2.1.1 離子交換層析結(jié)果

抗菌肽通常為具有陽(yáng)離子特性的多肽[28]。陽(yáng)離子交換層析是利用離子交換劑(即交換介質(zhì))上的可交換離子與周?chē)橘|(zhì)中被分離的各種離子間的親和力不同，即利用離子交換劑的荷電基團(tuán)，吸附樣品溶液中相反電荷的離子或離子化合物，被吸附的物質(zhì)隨后被帶同類(lèi)型電荷的其他離子所置換而被洗脫，由于各種不同的離子或離子化合物對(duì)離子交換劑的結(jié)合力不同，因而洗脫的速率不同形成了層析層從而達(dá)到分離的目的。本試驗(yàn)采用Capto S柱，首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行了層析分離，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 離子交換層析分離效果Fig.1 Separation effect of ion exchange chromatography

在Copto S離子交換色譜圖1中可以看出，各色譜峰之間分離效果還較差，色譜峰信號(hào)較弱。但實(shí)驗(yàn)證明了該抗菌肽具有陽(yáng)離子交換特性，屬于陽(yáng)離子肽或具有陽(yáng)離子特性的多肽。

發(fā)酵液經(jīng)Capto S層析后，洗脫共收集30管樣品，做抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第8管前后的收集液有抗菌活性，將有活性管合并，再用疏水層析柱層析。

2.1.2 疏水層析結(jié)果

疏水層析是利用多肽/蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)與親水基團(tuán)進(jìn)行分離，多肽/蛋白質(zhì)的表面通常具有疏水性基團(tuán)，其與層析介質(zhì)中帶有疏水性的載體在高鹽濃度時(shí)會(huì)結(jié)合，離子強(qiáng)度(鹽濃度)越高，結(jié)合所形成的疏水鍵越強(qiáng)，由于形成的結(jié)合力不同從而達(dá)到分離的目的。本試驗(yàn)采用苯基-瓊脂糖凝膠作為疏水介質(zhì)，對(duì)2.1.1中收集到的抑菌活性部分進(jìn)行分離，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 疏水層析分離效果Fig.2 Separation effect of hydrophobic chromatography

圖2顯示，經(jīng)過(guò)疏水層析后，其色譜峰分離效果較離子交換層析有所提高，但各蛋白質(zhì)峰仍然相互重疊，不能被完全分開(kāi)。對(duì)分步收集樣品做抑菌活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)第7管有1個(gè)明顯的色譜峰，且該時(shí)間段的樣品有抑菌活性。

2.1.3 尺寸排阻層析結(jié)果

尺寸排阻層析是基于分子的大小不同進(jìn)行分離，是一種非吸附形式的層析方法，因此緩沖液的成分不會(huì)直接影響分離結(jié)果，目的抗菌肽可以在廣泛的pH值及離子強(qiáng)度下進(jìn)行物質(zhì)的分離。本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠G-100作為填料對(duì)上述收集的活性洗脫液進(jìn)行尺寸排阻層析，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 尺寸排阻分離效果Fig.3 Separation effect of size exclusion

圖3顯示，樣品色譜峰分離效果較疏水層析有所提高，有明顯的優(yōu)勢(shì)峰，抑菌活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第16管有抑菌活性，收集活性組分，冷凍干燥備用。

2.1.4 分步層析分離物的抑菌活性比較

以質(zhì)量濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素溶液為陽(yáng)性對(duì)照，緩沖液為陰性對(duì)照，開(kāi)展了分步串聯(lián)層析不同層析柱收集液對(duì)E.coli和S.entericasubsp.enterica抑菌試驗(yàn)比較，結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。對(duì)于2株供試靶標(biāo)菌而言，氨芐青霉素陽(yáng)性對(duì)照均具有明顯抑菌圈，而陰性對(duì)照蒸餾水則無(wú)抑菌圈。在串聯(lián)柱層析系統(tǒng)中，3種層析均收集到了能夠抑制2株供試靶標(biāo)菌的活性組分，陽(yáng)離子交換層析活性相對(duì)弱于疏水層析和尺寸排阻層析收集到組分的抑菌活性，而經(jīng)過(guò)疏水層析收集到組分的活性又相對(duì)弱于尺寸排阻層析收集到組分的活性。即抑菌活性(抑菌圈)大小順序?yàn)椋宏?yáng)離子交換層析<疏水層析<尺寸排阻層析。

a-靶標(biāo)菌為大腸桿菌；b-靶標(biāo)菌為沙門(mén)氏桿菌圖4 串聯(lián)柱層析收集液抑菌實(shí)驗(yàn)Fig.4 Antibacterial activity of tandem column chromatography

表1 串聯(lián)柱層析收集液抑菌直徑Table 1 The antibacterial diameter of the column chromatography

注：“-”表示無(wú)活性；CK為0.02 mol/L、pH 5.8 PBS緩沖液；陽(yáng)性對(duì)照為：100 μg/mL的氨芐青霉素溶液;不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.2 反相HPLC分離純化抗菌物質(zhì)

按照1.3.3所述的色譜條件進(jìn)行反相 HPLC分離純化，收集每峰共19個(gè)樣品，冷凍干燥。以沙門(mén)氏菌作為指示菌，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)檢測(cè)每個(gè)樣品的活性。結(jié)果表明:第8峰樣品組分具有明顯的抑菌效果，結(jié)果見(jiàn)圖5和表2。

圖5 半純品的高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Semi-pure liquid with high performance liquid chromatography

表2 RP-HPLC色譜各洗脫峰抑菌效果Table 2 Antibacterial effect of elution fractions purification from RP-HPLC chromatography

注：“-”表示無(wú)活性；CK為0.02 mol/L、pH 5.8 PBS緩沖液。

2.3 質(zhì)譜分析抗菌肽氨基酸序列

經(jīng)反相HPLC分離后抗菌活性組分進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析(圖6)得到該抗菌肽的氨基酸序列為：Pro-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu，是一種富脯氨酸抗菌肽。由ExPasy中的ProtParam軟件計(jì)算得到其分子質(zhì)量為1 567.86 Da，等電點(diǎn)為10.84。將該肽段的氨基酸序列利用NCBI做同源性分析[29]，與之序列相似性最高的僅為44.3 %，發(fā)現(xiàn)其為一種未報(bào)道的多肽，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有與之序列相匹配的蛋白質(zhì)，可以證明本研究分離純化到的B.subtitesB3抗菌肽很可能是一個(gè)新的蛋白質(zhì)。

圖6 質(zhì)譜分析譜圖Fig.6 Tandem mass spectrometry

2.4 最小抑菌濃度測(cè)定

由表3可知，該抗菌肽對(duì)E.coli和S.entericasubsp.enterica都有抑菌效果，且在濃度較低時(shí)依然保持穩(wěn)定的活性，對(duì)2種靶標(biāo)菌的最小抑菌質(zhì)量濃度均為0.020 312 μg/mL。

表3 抗菌肽的抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of antimicrobial peptides

注：—無(wú)抑菌效果。

2.5 耐熱性檢測(cè)

由圖7可知抗菌肽在40～100 ℃加熱后對(duì)E.coli和S.entericasubsp.enterica的抑菌活性變化不大，在100 ℃以下沒(méi)有顯著的變化，而在110 ℃抑菌活性出現(xiàn)下降，在121 ℃加熱后喪失抑菌活性，可見(jiàn)抗菌肽在110 ℃以下具有較好的耐熱性。

圖7 不同溫度加熱對(duì)抗菌肽抑菌活性的影響Fig.7 Effects of different temperature heating on antimicr-obial activity of antibacterial peptides注：豎線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.6 耐酸堿度檢測(cè)

由圖8可知抗菌肽在pH 4～11時(shí)具有較穩(wěn)定的抑菌活性，當(dāng)pH超過(guò)11后抑菌活性明顯受到影響，可見(jiàn)，該抗菌肽對(duì)酸、堿度具有較好的穩(wěn)定性。

圖8 不同pH對(duì)抗菌肽抑菌活性的影響Fig.8 Effects of different pH on antimicrobial activity of antibacterial peptides注：豎線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。

2.7 光照穩(wěn)定性檢測(cè)

由圖9可知該抗菌肽在光照射時(shí)長(zhǎng)10 min～48 h處理后對(duì)E.coli和S.entericasubsp.enterica的抑菌活性沒(méi)有變化，可見(jiàn)該抗菌肽對(duì)光照具有較好的穩(wěn)定性。

圖9 不同光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)抗菌肽抑菌活性的影響Fig.9 Effect of different illumination time on antimicrobial activity of antibacterial peptides(注：豎線(xiàn)表示標(biāo)準(zhǔn)誤(±SE)，不同字母表示不同處理間差異顯著。)

3 討論

枯草桿菌具有良好的分泌性和非致病性等生物學(xué)特點(diǎn)，從枯草芽孢桿菌中提取抗菌肽具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[30]。徐建研究了表達(dá)PBD-2和cecropin P1抗菌肽的枯草芽孢桿菌，其所得的抗菌肽活性穩(wěn)定，對(duì)多種革蘭氏陰性菌，特別是腸桿菌科(Enterobacterhormaeche和Edwards)細(xì)菌，具有很強(qiáng)的傷殺作用，而對(duì)包括乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)在內(nèi)的革蘭氏陽(yáng)性菌不起作用，并且對(duì)真核細(xì)胞沒(méi)有毒性作用[31]；莊國(guó)宏等人研究了1株能產(chǎn)生對(duì)大腸桿菌(E.coli)具有明顯抑殺作用抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株，其所得的抗菌肽具有抑菌譜較廣、性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，在初步機(jī)理的研究中還發(fā)現(xiàn)該菌能夠引起腸桿菌細(xì)胞膜穿孔，細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)泄漏、代謝活力下降及菌體破裂等，從而達(dá)到抑菌殺菌功效[32]。

本研究獲得的產(chǎn)抗菌肽枯草芽孢桿菌B3菌株，經(jīng)一系列試驗(yàn)證明，其產(chǎn)生的抗菌肽對(duì)E.coli和S.entericasubsp.enterica具有高效的抑菌效果，而且部分理化性質(zhì)穩(wěn)定，具備開(kāi)發(fā)為一種高效新型抑菌劑的潛質(zhì)，可為新型抗菌肽的開(kāi)發(fā)提供菌株來(lái)源。但如何保證抗菌肽在外源性蛋白酶中的穩(wěn)定性，避免抗菌肽發(fā)生降解而降低活性等問(wèn)題，將是今后進(jìn)一步研究的重點(diǎn)。同時(shí)，由于目前對(duì)于抗菌肽的開(kāi)發(fā)利用主要是基于其高效抑菌性和獨(dú)特抑菌機(jī)理而進(jìn)行的。因此，探明枯草芽孢桿菌B3菌株來(lái)源抗菌肽的抑制作用機(jī)理也很必要，在開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品之前亟待研究解決。

4 結(jié)論

綜合采用串聯(lián)柱層析法和反相色譜方法，從一株分離自甘肅河西鹽堿土壤中的枯草芽孢桿菌B3菌株(BacillussubtilisB3)發(fā)酵液中，分離純化出了一種對(duì)大腸桿菌(E.coli)和沙門(mén)氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)具有抑菌作用的抗菌肽，并以其菌株發(fā)酵產(chǎn)物為樣品，經(jīng)串聯(lián)層析系統(tǒng)和反向色譜技術(shù)純化后的抗菌肽，通過(guò)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)信息分析，結(jié)果表明該抗菌肽是一種小分子的富脯氨酸抗菌肽，其氨基酸序列Pro-Tyr-Ile-Pro-Gln-Pro-Arg-Pro-Pro-His-Pro-Arg-Leu，分子質(zhì)量為1 567.86 Da，等電點(diǎn)為10.84。經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其為一種未報(bào)道的多肽。該抗菌肽對(duì)大腸桿菌(E. coli)和沙門(mén)氏桿菌(S.entericasubsp.enterica)的最小抑菌質(zhì)量濃度均為0.020 312μg/mL。同時(shí)，該抗菌肽表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐熱性、耐酸堿性和光照穩(wěn)定性。