小鼠中年期和老年期睪丸組織轉(zhuǎn)錄組分析

張 濤，楊理凱，路宏朝，王 令，劉 歡，左甜甜

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723001)

老齡化問題已成為世界各國面臨的共同課題，中國老齡化速度不斷加快。衰老涉及內(nèi)分泌系統(tǒng)多個(gè)方面的改變，包括腎上腺、甲狀腺、垂體生長激素、性腺、骨礦物質(zhì)代謝和糖代謝等[1-2]。Holladne等在1958年發(fā)現(xiàn)老年男子的睪丸精索靜脈睪酮水平低于青年男子[3]，是衰老降低睪酮產(chǎn)生的有力證據(jù)。近年來，學(xué)者把由老齡化所導(dǎo)致的血液中雄激素低下為生物化學(xué)基礎(chǔ)的癥候群稱之為“部分雄激素缺乏綜合征(partial androgen deficiency of agingmale,PADAM)”，臨床表現(xiàn)為失眠、健忘、性功能障礙等多種老年性疾病[4-5]。睪丸是精子產(chǎn)生的場所，并分泌雄激素。精子在曲精小管中從精原干細(xì)胞到精母細(xì)胞，然后通過減數(shù)分裂形成精子，該過程也涉及睪丸中支持細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞等。睪丸支持細(xì)胞分布在曲精小管，負(fù)責(zé)生殖細(xì)胞的營養(yǎng)與保護(hù)，而間質(zhì)細(xì)胞分布于睪丸間質(zhì)中[6]，在腦垂體分泌的黃體生成素作用下，生成和分泌雄激素——睪酮，促進(jìn)性腺發(fā)育、精子發(fā)生，維持男性性征[7]，男性40歲后隨著年齡的增長，下丘腦-垂體-睪丸軸功能減退，睪丸功能降低。

睪丸作為雄性的主要標(biāo)志器官，其生長發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜而精密的生理過程，隨著年齡老化而出現(xiàn)睪丸內(nèi)分泌變化與功能衰退，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由于衰老對下丘腦-垂體-睪丸軸功能產(chǎn)生影響而導(dǎo)致，目前已開展大量人與動物睪丸發(fā)育[8]、損傷與保護(hù)[9]及組織中基因表達(dá)差異[10]等研究，但是相關(guān)的生理機(jī)制和分子機(jī)理仍然沒有闡述清楚。測序技術(shù)的出現(xiàn)為人類從分子水平解析生命的奧秘提供新的途徑，轉(zhuǎn)錄組測序與分析技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)有20多年，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的研究，且對小鼠不同發(fā)育階段睪丸組織中不同類型細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)行研究[11-13]，但多數(shù)研究集中在胚胎期、幼年、青年和成年期，而關(guān)于中年期和老年期的睪丸組織的轉(zhuǎn)錄組研究未見報(bào)道。本研究選取出生后180日齡和360日齡小鼠，分別代表中年期和老年期，采用Illumina Hiseq測序平臺對睪丸組織的基因表達(dá)情況進(jìn)行比較分析，為探討睪丸功能退化的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，以期為老齡化過程中生物學(xué)與醫(yī)學(xué)等某些方面科學(xué)問題的解決提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

C57BL小鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)室長期飼養(yǎng)，選取中年期(180日齡)和老年期(360日齡)的睪丸組織進(jìn)行研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取 每只小鼠取 1 個(gè)睪丸，按照Trizol Reagent 試劑盒的操作流程提取總RNA，測定質(zhì)量濃度后按照中年期和老年期 2 個(gè)組分別將 3 個(gè)樣本等量混合構(gòu)建 cDNA 文庫。

1.2.2 測序文庫的構(gòu)建 基于 mRNA 特有的Poly(A)結(jié)構(gòu)進(jìn)行 mRNA 純化。通過離子打斷的方式將 mRNA 打斷為 200～300 bp。采用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成 cDNA 第 1 條鏈，合成第 2 條 cDNA 鏈時(shí)將 dTTP 替換成 dUTP，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。cDNA 文庫構(gòu)建完成后，采用 PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集，建立測序文庫，文庫大小在 300～400 bp，最后通過 Agilent 2100Bioanalyzer 對文庫進(jìn)行質(zhì)檢。

1.2.3 Illumina測序 選擇上海派森諾生物科技有限公司 Illumina Hiseq 測序平臺對文庫進(jìn)行雙末端(Paired End，PE)測序 。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用 Cutadapt(Version 1.2.1)除去3′端的接頭，數(shù)據(jù)平均含量按照 Q20 標(biāo)準(zhǔn)控制。進(jìn)行比對的參考基因組數(shù)據(jù)來源為 Ensembl 數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ensembl.org/)，參考的基因組信息為Mus_musculus.GRCm38.dna.primary_assembly.fa，數(shù)據(jù)庫版本為 Ensembl 86.38。通過 Bowtie2 建立參考基因組索引，然后使用 Tophat2(http:∥tophat.cbcb.umd.edu/)將過濾后的 Reads 比對到參考基因組上。

1.2.5 差異基因篩選 使用 HTSeq 0.6.1p2(http:∥wwwhuber.embl.de/users/anders/HTSeq)統(tǒng)計(jì)比對到每一個(gè)基因上ReadCount 值，作為基因的原始表達(dá)量。采用 RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)[14]對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(Normalization)。采用 DESeq(version 1.18.0)[15]對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)倍數(shù)差異 |fold change| > 2，顯著性P<0.05。采用 R 語言 ggplots2 軟件包繪制差異表達(dá)基因的火山圖和 MA 圖。

1.2.6 GO與KEGG分析 將所有檢測到的基因映射到GO(Gene Ontology)數(shù)據(jù)庫每一個(gè) Term，計(jì)算每個(gè) Term 的差異基因數(shù)目，以整個(gè)基因組為背景，采用超幾何分布計(jì)算差異基因顯著富集的 Term 及相應(yīng)功能；在 KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)數(shù)據(jù)庫比對差異表達(dá)基因，統(tǒng)計(jì)各個(gè) KEGG Pathway 各層級的差異表達(dá)基因數(shù)目，確定差異表達(dá)基因主要參與的代謝途徑和信號通路。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

由表1可知，2個(gè)樣品分別獲得25 479 636和 29 158 408 條 reads，總堿基數(shù)分別為3 847 425 036 bp和 4 402 919 608 bp，其中識別準(zhǔn)確率在 99.9% 以上的堿基總數(shù)為 3 439 210 859 bp和 3 967 709 437 bp；Q20 值均在 95% 以上，Q30 在 89% 以上，結(jié)果表明測序質(zhì)量好，保證研究的可靠性。為了排除接頭和低質(zhì)量 Reads 對信息分析的干擾，試驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的過濾處理(表2)，試驗(yàn)兩個(gè)樣品分別檢測到 25 187 980 個(gè)和28 840 576個(gè)有效的Reads，比對到參考基因組上的分別有 18 861 721 個(gè)和 22 355 657 個(gè)，占總讀數(shù)的 74.88% 和 77.51%。比對結(jié)果顯示比對效率較好，能比對到功能基因的比例分別為 76.51% 和 79.96%，其中比對到外顯子區(qū)的分別為 95.54% 和 96.06%，結(jié)果如表3所示，說明測序的數(shù)據(jù)豐富，有效性好。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

為系統(tǒng)了解小鼠中年期及老年期睪丸組織基因表達(dá)情況，筆者計(jì)算檢測到的每一個(gè)基因的 RPKM 值，如表4所示。轉(zhuǎn)錄組研究領(lǐng)域的主流雜志提出，在有參轉(zhuǎn)錄組當(dāng)中，一般認(rèn)為 RPKM>1的基因是表達(dá)的，RPKM 能夠很好地反應(yīng)基因的表達(dá)水平。在中年期小鼠的睪丸組織可檢測到 17 770個(gè)基因的表達(dá)，其中 RPKM 值小于 1 的基因占 62.15%，大于 100 的基因占 0.80%；在老年期小鼠的睪丸組織中，檢測到 18 073 個(gè)基因的表達(dá)，其中 RPKM 值小于1的基因占61.45%，大于 100 的基因占 0.74%?；鹕綀D可直觀反映基因的分布情況，MA圖常用來評估文庫Normalization的質(zhì)量，結(jié)果表明(圖1、圖2)中年期和老年期睪丸組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平存在較大差異。以中年期為對照，老年期表現(xiàn)下調(diào)基因 122 個(gè)，上調(diào)基因 185 個(gè)(圖3) 其中上調(diào)基因中可注釋的 181 個(gè)，下調(diào)基因可注釋的 104 個(gè)。所有差異表達(dá)基因中，RPKM>1 的基因共有 57 個(gè)，下調(diào) 18 個(gè)，上調(diào) 39 個(gè)。

表1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評價(jià)分析Table 1 Evaluation of transcriptome sequencing data

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)比對結(jié)果基本統(tǒng)計(jì)Table 2 Basic statistics of transcriptome sequencing data

表3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對區(qū)域分布統(tǒng)計(jì)Table 3 Transcriptome data comparison regional distribution statistics

2.3 GO分類

利用 Blast2GO 軟件對 307 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析表明，285 個(gè)基因可以分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能 3 大類別 25 小類，共涉及生物過程的 1 625 個(gè)條目，細(xì)胞組分的 244 個(gè)條目，分子功能的 333 個(gè)條目。 差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分分類下主要涉及膜及其組成相關(guān)的各種功能，其中最多的是膜的整體組成(圖4)。在生物過程大類下基因涉及的生物學(xué)功能最復(fù)雜，涉及基因較多的是轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、氧化還原過程、轉(zhuǎn)錄調(diào)控與DNA模板化和老齡化。在分子功能分類中，氧化還原酶活性所占比例最多，其次是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和裂解酶活性。此外，從圖4也可以看出，與生殖發(fā)育和衰老相關(guān)的生物學(xué)過程有細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)、免疫系統(tǒng)過程、骨化、老化、絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性、氧化還原酶活性等。

表4 不同生長時(shí)期睪丸組織RPKM值Table 4 FPKM value of testis tissue in different growth stages

圖1 差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Valcano chart of differentially expressed genes

圖2 差異表達(dá)基因MA圖Fig.2 MA chart of differentially expressed genes

圖3 中年期與老年期睪丸組織差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)Fig.3 Statistics of differentially expressed genes in middle-and old-aged mouse

B1.炎癥反應(yīng)正向調(diào)節(jié) Positive regulation of inflammatory response； B2.氧化還原過程 Oxidation-reduction process；B3.骨化 Ossification；B4.老化 Aging；B5.運(yùn)輸 Transport；B6.RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié) Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter；B7.轉(zhuǎn)錄正調(diào)節(jié)，DNA模板化 Positive regulation of transcription, DNA-templated；B8.膜轉(zhuǎn)運(yùn) Transmembrane transport；B9.免疫系統(tǒng)過程 Immune system process；B10.調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖 Regulation of cell proliferation；C1.細(xì)胞外外泌體 Extracellular exosome；C2.細(xì)胞外區(qū)域 Extracellular region；C3.內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic reticulum；C4.細(xì)胞外空間 Extracellular space；C5.內(nèi)體 Endosome；C6.質(zhì)膜的整體成分 Integral component of plasma membrane；C7.膜的整體組成部分 Integral component of membrane；C8.質(zhì)膜 Plasma membrane；C9.膜 Membrane；M1.絲氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性 Serine-type endopeptidase inhibitor activity；M2.氧化還原酶活性 Oxidoreductase activity；M3.轉(zhuǎn)運(yùn)體活性 Symporter activity；M4.裂解酶活性 Lyase activity；M5.運(yùn)輸活動 Transporter activity；M6.肝素結(jié)合 Heparin binding

2.4 KEGG富集分析

通過KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因比對與富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 301 個(gè)基因歸納到 5 個(gè)大類的 18 個(gè)小類中，共涉及 139 個(gè)信號通路，如圖5所示。結(jié)果表明，這些差異表達(dá)基因主要參與的前 5 個(gè)代謝通路為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝、碳水化合物代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)。KEGG 歸類分析后，篩選出 RPKM>1 的 57 個(gè)基因，并統(tǒng)計(jì)分析這些基因涉及的信號通路，最終檢測到 20 個(gè)基因涉及 35 個(gè)信號通路(表5)。小鼠中年期睪丸組織有 6 個(gè)基因顯著上調(diào)，涉及PPAR 信號通路、脂類調(diào)控、補(bǔ)體系統(tǒng)、氮代謝、嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)、吞噬體、腸免疫網(wǎng)絡(luò)、抗原加工與展示和細(xì)胞粘附分子等 9個(gè)信號通路。而在老年期檢測到 15 個(gè)基因上調(diào)，涉及20個(gè)信號通路，主要包括花生四烯酸代謝、卵巢類固醇生成、類固醇激素生成、醛固酮的生成與分泌、腎素血管生成素系統(tǒng)、血管平滑肌、腎素分泌、氨基酸代謝、催產(chǎn)素信號通路、促性腺激素釋放激素、TNF信號通路、甘油三酯代謝、補(bǔ)體系統(tǒng)、胰島素、溶酶體和鞘脂類代謝與信號通路。

A.異生素的生物降解和代謝 Xenobiotics biodegradation and metabolism;B.概述 Overview; C.核苷酸代謝 Nucleotide metabolism;D.其他氨基酸的代謝 Metabolism of other amio acids;E.油脂代謝 Lipid metabolism;F.聚糖生物合成和代謝 Glycan biosynthesis and metabolism;G.碳水化合物代謝 Carbohydrate metabolosm;H.氨基酸代謝 Amio acidsmetabolism;I.感官系統(tǒng) Sensory system;J.神經(jīng)系統(tǒng) Nervous system;K.免疫系統(tǒng) Immune system;L.內(nèi)分泌系統(tǒng) Endocrine system;M.循環(huán)系統(tǒng) Circulatory system;N.信號分子和相互作用 Signaling molecules and interaction;O.信號傳導(dǎo) Signal transduction;P.運(yùn)輸和分解代謝 Transport and catabolism;Q.細(xì)胞群落 Cellular community;R. 翻譯 Translation

3 討論與結(jié)論

3.1 轉(zhuǎn)錄組測序可靠性分析

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)為基因表達(dá)及調(diào)控研究和生物重要性狀候選基因的鑒定提供新的途徑，尤其在不同物種、不同發(fā)育階段及不同組織之間挖掘差異表達(dá)基因具有重要作用[16]。本研究通過 Illumina Hiseq 測序平臺分析檢測小鼠中年期和老年期睪丸組織的 cDNA 文庫，獲得小鼠睪丸組織在中、老年期大量的基因表達(dá)信息與變化差異，結(jié)果表明，選擇的試驗(yàn)材料測序質(zhì)量好，各樣品的 Q20 均在 95% 以上，Q30 均在 89%以上；在小鼠中年期和老年期睪丸組織分別檢測到 25 187 980 個(gè)和 28 840 576 個(gè)可用的 Reads，比對效率分別達(dá)到 74.88% 和 77.51%；測序質(zhì)量高于前期小鼠睪丸組織 6 日齡 (52.87%) 4 周齡(56.70%)和 10 周齡 (62.35%) 的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果[13]，也比其他物種如鴨卵巢組織(70.92%和72.70%)[16]和綿羊(68.05%和71.82%)[17]等組織的高。

3.2 中年期和老年期睪丸組織基因差異表達(dá)分析

自從轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)出現(xiàn)以來，科學(xué)家就將該技術(shù)應(yīng)用到小鼠睪丸的基因表達(dá)研究，如抑制消減雜交(SSH)、表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag,EST)、cDNA微陣列和基因表達(dá)系列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)等技術(shù)。通過這些技術(shù)構(gòu)建小鼠的睪丸體細(xì)胞基因表達(dá)譜，鑒定出大量小鼠睪丸組織唯一表達(dá)標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)一些在睪丸生精細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞特異表達(dá)的基因，并在小鼠不同發(fā)育階段檢測到許多與精子生成有關(guān)的差異表達(dá)基因[11-12]。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)更能敏感地檢測樣本間的基因差異表達(dá)。龔未等[13]采用超高通量新一代 Technologies SOLiD 測序平臺分析 6 日齡、4 周齡和 10 周齡小鼠睪丸組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù),鑒定出 18 837 個(gè)基因，同時(shí)鑒定不同發(fā)育階段差異表達(dá)的基因。但目前利用高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析小鼠中年期和老年期睪丸組織的基因差異表達(dá)未見報(bào)道。

本研究對小鼠中年期和老年期睪丸組織cDNA文庫進(jìn)行分析，共檢測到 307 個(gè)表達(dá)差異的基因，可注釋的 271 個(gè)，上調(diào) 173 個(gè)，下調(diào) 98 個(gè)，其中 264 個(gè)基因獲得 GO 功能注釋，187 個(gè)基因清楚涉及 KEGG 代謝通路。由于小鼠作為模式生物研究的比較深入，比對數(shù)據(jù)庫中的參考基因比較全面，所以本研究中檢測到差異表達(dá)基因功能在 GO、KEGG 中被注釋的比例比其他物種覆蓋度高。但是，也有一些基因沒有被注釋到，也沒有歸入到相應(yīng)的 GO 和 KEGG 功能分類，分析原因可能是目前小鼠睪丸組織的研究多數(shù)集中于胚胎發(fā)育和青年期，而中年期和老年期的研究相對較少，而那些到中老年期后表達(dá)的一些特異基因沒有被發(fā)現(xiàn)，也有可能是轉(zhuǎn)錄組測序及拼接序列較短，獲得注釋信息的可能性就降低。

表5 差異表達(dá)基因涉及的信號通路Table 5 Differentially expressed genes involved in signaling pathways

3.3 差異表達(dá)基因的功能分析

GO 歸類分發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞組分大類中涉及的基因比較集中，主要是膜相關(guān)類別，說明在小鼠中老年期和老年期睪丸生理活動中的差異表達(dá)基因主要與膜的生物學(xué)功能相關(guān)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)一些基因涉及細(xì)胞外的活動，該結(jié)果與龔未等[13]通過轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)研究小鼠出生后的基因差異表達(dá)研究是一致，說明細(xì)胞外活動相關(guān)基因貫穿小鼠睪丸整個(gè)生理生化過程。而在生物過程中差異表達(dá)基因涉及的范圍比較分散和多樣，各組分中相關(guān)基因數(shù)量較少，且差異不明顯，這與其前期關(guān)于小鼠睪丸組織和其他物種的研究基本一致，推斷生物過程在睪丸組織中是最基本的代謝途徑。對分子功能大類的分析發(fā)現(xiàn)，氧化還原酶活性所占比例最多，可能與老齡化密切相關(guān)，隨著年齡增大，需要大量的氧化還原酶發(fā)揮抗衰老的作用。此外，也檢測到明顯與生殖發(fā)育、性功能及衰老相關(guān)的差異表達(dá)基因。本研究結(jié)果證實(shí)膜相關(guān)、細(xì)胞外、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原等類別在中老年睪丸組織中存在較大差別的基因表達(dá)，推測膜相關(guān)、細(xì)胞外、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原在睪丸功能退化的生理活動中可能具有重要的作用。

遺傳學(xué)已經(jīng)闡明，表型的產(chǎn)生有主效基因作用、微效多基因假說及其與環(huán)境互作效應(yīng)等機(jī)制?，F(xiàn)代生物學(xué)研究證明生物體中不同類型的生物學(xué)功能由多個(gè)基因相互協(xié)調(diào)進(jìn)行調(diào)控，形成一個(gè)精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過信號通路富集分析有助于系統(tǒng)而全面地解析基因功能。轉(zhuǎn)錄組分析可以檢測到不同物種或者不同時(shí)間與空間的遺傳表達(dá)差異，實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的信號通路富集分析。本研究檢測到與小鼠中年期和老年期睪丸組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異相關(guān)的 139 個(gè)信號通路，其中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脂代謝、碳水化合物代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等 5 個(gè)代謝通路涉及的差異表達(dá)基因較多，同時(shí)與癌癥和免疫學(xué)疾病相關(guān)的信號通路富集一些基因。有研究報(bào)道，在有參照轉(zhuǎn)錄組分析當(dāng)中，一般認(rèn)為 RPKM>1 的基因是表達(dá)的，本研究著重將差異表達(dá)基因中 RPKM>1 的進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)中年期和老年期小鼠睪丸組織在脂代謝、GnRH 信號通路、固醇類激素生成、TNF 信號通路、補(bǔ)體系統(tǒng)、胰島素和溶酶體相關(guān)等信號通路存在較大差異。本研究中涉及脂肪合成與代謝的有脂肪酸結(jié)合蛋白4( FABP4)、內(nèi)皮脂肪酶(Lipg)、蠟樣脂褐質(zhì)沉著癥神經(jīng)元5( Cln5)和鞘磷脂磷酸二酯酶1酸性溶酶體( Smpd1)。 FABP4 在脂肪、卵巢和睪丸組織中廣泛分布，能結(jié)合多種疏水性化合物，參與脂肪酸的合成[18]，該基因的缺失可增加脂肪酸濃度，促使脂肪分解[19]。本研究中發(fā)現(xiàn)年小鼠睪丸組織中 FABP4 的表達(dá)水平高于老年小鼠，說明睪丸組織隨著年齡的增加脂肪分解能力提高，貯存脂肪能力減少，為激素合成與精子生成提供的能量就不足。Lipg在內(nèi)皮細(xì)胞合成，冠狀動脈、肝臟、肺、睪丸、腎臟和卵巢多種組織中表達(dá)，主要功能是參與脂蛋白代謝，其磷脂酶活性強(qiáng)于甘油三酯酶，對富含磷脂的高密度脂蛋白的水解作用更強(qiáng)，在動物試驗(yàn)和人體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮脂酶的水平與高密度脂蛋白(HDL-C)的水平呈負(fù)相關(guān)[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)Lipg與炎癥反應(yīng)也有密切的聯(lián)系，可促進(jìn)細(xì)胞間黏附因子1的表達(dá)及單核細(xì)胞對血管內(nèi)皮粘的附作用，這都與老齡化有密切的關(guān)系。本研究在小鼠中年期和老年期均檢測到該基因表達(dá)，且老年小鼠睪丸組織中Lipg基因表達(dá)水平顯著高于中年小鼠，結(jié)果與其組織器官的研究基本一致。

睪丸雄激素的合成由下丘腦分泌的 GnRH 調(diào)節(jié)，其通過促進(jìn)垂體分泌促性腺物質(zhì)影響性激素生成而影響雄性動物生殖活動[21]。本研究中 GnRH 信號通路和 TNF 信號通路涉及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-14)，睪丸組織中老年鼠要顯著高于中年鼠，有研究報(bào)道 MMP-14 異常表達(dá)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[22-23]，說明老齡化可增加患惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。前列腺素D合成酶(Prostaglandin D synthase，PGDS)催化不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物前列腺素 H2(PGH2) 發(fā)生異構(gòu)化生成，其分為腦型脂質(zhì)運(yùn)載蛋白 PGDS(lipocalin-PGDS，LPGDS) 和生血型 PGDS(hematopoietic PGDS，hPGDS)[24]。LPGDS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、雄性生殖器官和心臟等組織分布，具有轉(zhuǎn)運(yùn)親脂性物質(zhì)和催化 PGD2 合成的雙重功能，在腦脊液、精漿及血漿內(nèi)都可檢測到[25-26]。關(guān)于LPGDS如何影響雄性生殖能力的研究還沒有清楚解析，但推測其攜帶腎上腺素、類固醇、維生素A等越過血-睪屏障幫助精子細(xì)生成與成熟。本研究中LPGDS基因在老年期小鼠睪丸組織的表達(dá)水平顯著高于中年期，可以作為其功能研究的一個(gè)切入點(diǎn)。此外，補(bǔ)體系統(tǒng)、胰島素、溶酶體、氨基酸代謝和嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)等檢測到一些差異表達(dá)基因，其在睪丸生理生殖活動中的作用還需進(jìn)一步研究。

本研究對中年期和老年期小鼠睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，檢測小鼠睪丸組織不同年齡階段基因表達(dá)的差異及相關(guān)的信號通路。該研究為豐富小鼠睪丸組織轉(zhuǎn)錄組信息提供中老年期的數(shù)據(jù)，也為探討睪丸功能退化及其在老齡化過程中生物學(xué)與醫(yī)學(xué)等某些方面的研究奠定基礎(chǔ)。