藍(lán)光受體基因Cmwc-1和Cmwc-2的原核表達(dá)和蛹蟲(chóng)草中表達(dá)蛋白的檢測(cè)

鐘雪晴，葉德曉，毛玉梅，付鳴佳，楊志海

(江西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330022)

藍(lán)光是重要的環(huán)境因素，近年在動(dòng)物[1-2]、植物[3-5]、真菌[6-8]和細(xì)菌[9-10]等多種生物中進(jìn)行了相關(guān)的生理生化和分子生物學(xué)研究。真菌中感受藍(lán)光信號(hào)的藍(lán)光受體蛋白研究已經(jīng)很多，尤其在模式真菌粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中藍(lán)光受體蛋白的研究較清楚[11-13]。脈孢菌中的2個(gè)重要的藍(lán)光受體蛋白White Collar-1(WC-1)和White Collar-2(WC-2)均為GATA型鋅指蛋白(Zinc finger protein)，帶有DNA結(jié)合域[14-16]。WC-1和WC-2均帶有PAS(Per-Arnt-Sim)功能域和NLS(Nuclear localization signal，核定位信號(hào))功能域，其中，WC-1有3個(gè)PAS域，WC-2僅有1個(gè)PAS域[17-21]。在WC-1的一個(gè)PAS域中含有一個(gè)LOV(Light oxygen voltage domain)結(jié)構(gòu)域，為藍(lán)光感光器。通過(guò)PAS域可以將WC-1和WC-2結(jié)合成WCC復(fù)合體(White collar complex)[17-19]。此外，在WC-1和WC-2中均帶有多聚谷氨酰胺轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，且在WC-2中還含有一個(gè)coiled-coil域[17-21]。WC-1和WC-2這些功能域的存在，帶給粗糙脈孢菌感知光照變化的生物鐘功能[16-17，22]。

WCC作為WC-1和WC-2的復(fù)合物，可以與生物鐘基因frq一起共同作用形成光誘導(dǎo)的一系列基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致藍(lán)光誘導(dǎo)和調(diào)控。這種藍(lán)光的調(diào)控主要是WCC可以與鐘基因frq上的啟動(dòng)子結(jié)合并激活frq基因的表達(dá)[23]。有研究表明，當(dāng)wc-1基因或wc-2基因缺失的時(shí)候，在細(xì)胞中的frq基因的表達(dá)水平很低[24]。研究還發(fā)現(xiàn)，WCC既可感受光的存在，又可感受光照在環(huán)境中的變化。當(dāng)WCC感受外界光照變化時(shí)，可以形成不同的聚合物形式：光照條件下，WCC由WC-1與WC-2形成四聚體結(jié)構(gòu)并以該結(jié)構(gòu)行使功能；黑暗條件下，WCC由WC-1與WC-2形成二聚體結(jié)構(gòu)并以該結(jié)構(gòu)行使功能[25]。由此表明，藍(lán)光受體蛋白WC-1和WC-2與生物鐘蛋白FRQ共同的調(diào)控，形成了生物體的節(jié)律性特征，即生物鐘。

除了在脈孢菌中存在藍(lán)光受體WC-1和WC-2以及WCC復(fù)合物以外，在其他真菌中也存在類(lèi)似功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。在靈芝(Ganodermalucidum)中克隆到藍(lán)光受體基因Glwc-1 和Glwc-2，其結(jié)構(gòu)與脈孢菌中的藍(lán)光受體基因wc-1和wc-2類(lèi)似[26]；在一種地下真菌松露(Tubermelanosporum)中檢測(cè)到與脈孢菌同源的wc-1和wc-2高水平表達(dá)[27]。也有研究者確定了藍(lán)光受體可以上調(diào)某些基因的表達(dá)，其中深綠木霉(Trichodermaatroviride)中的藍(lán)光受體可以上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子blu7基因的表達(dá)，并由此調(diào)節(jié)光感應(yīng)和耐受性[28]。在冬蟲(chóng)夏草(Ophiocordycepssinensis)中克隆到藍(lán)光受體基因Oswc-1，其序列與wc-1同源[29]。在煙草赤星病菌(Alternariaalternata)中的藍(lán)光受體LreA(與wc-1同源)，其基因的表達(dá)影響到孢子和次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[30]。此外，煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)中也存在藍(lán)光受體LreA，盡管與脈孢菌中的WC-1只有45%的同源性，但仍然包含了WC-1中行使功能的所有類(lèi)型結(jié)構(gòu)域[31]。在植物病原真菌灰霉病菌(Botrytiscinerea)中也存在WCC復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的存在與病原菌的致病性有關(guān)[32]。在裂褶菌(Schizophyllumcommune)中，藍(lán)光受體復(fù)合物WC-1/2(即WCC)與菇的形成和光毒性有關(guān)，可以影響到光裂合酶(Photolyase)和亞鐵螯合酶(Ferrochelatase)的活性[33]。

蛹蟲(chóng)草(Cordycepsmilitaris)已經(jīng)被確定為新資源食品，是一種傳統(tǒng)的藥用真菌。其藍(lán)光受體基因Cmwc-1和Cmwc-2已經(jīng)被克隆[34-35]，對(duì)Cmwc-1和Cmwc-2的表達(dá)特性也進(jìn)行了初步研究[34]，且已經(jīng)知道CmWC-1對(duì)子實(shí)體的形成和次生代謝物的產(chǎn)生有影響[36]。為了更為深入地研究Cmwc-1和Cmwc-2在蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中的具體功能，本研究通過(guò)原核表達(dá)藍(lán)光受體蛋白而制備了這2種藍(lán)光受體蛋白的抗體，并進(jìn)行了初步的檢測(cè)，為進(jìn)一步深入研究蛹蟲(chóng)草藍(lán)光信號(hào)系統(tǒng)打下了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和載體 蛹蟲(chóng)草和大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株DH5α和BL21(DE3)由真菌分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程公司；表達(dá)載體pET-41a(+)為美國(guó)Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 儀器與試劑 S1000TMthermal cycler Chassis 型 PCR 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司；D-37520 Osterode臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；DYY-12 型電泳儀和 DYCp31D 型水平電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠。TRIzol 試劑、蛋白酶抑制劑和第一鏈 cDNA 合成試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit With gDNA Eraser均為生工生物工程(上海)有限公司新產(chǎn)品；ProteinIsoTMNi-NTA Resin蛋白質(zhì)純化柱購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；福氏完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ProteinA親和介質(zhì)購(gòu)自美國(guó)GE公司；HRP-羊抗兔IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DAB顯色試劑為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。引物合成及測(cè)序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲(chóng)草的培養(yǎng) 菌絲體培養(yǎng)：將蛹蟲(chóng)草菌種接種于含1%奶粉的PDA 培養(yǎng)基上，24 ℃培養(yǎng)菌絲體。子實(shí)體培養(yǎng)：在100 mL PDA液體培養(yǎng)基中接入蛹蟲(chóng)草菌種，20 ℃搖菌培養(yǎng)至菌絲體成為球狀即成液體菌種，培養(yǎng)約4～5 d。同時(shí)將30 g優(yōu)質(zhì)大米置入培養(yǎng)瓶中，加入PDA液體培養(yǎng)基35 mL，高溫高壓滅菌以后成為大米培養(yǎng)基。接種5 mL液體菌種到大米培養(yǎng)基中，在20 ℃、RH≈75%條件下避光培養(yǎng)至菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)大米培養(yǎng)基中，而后開(kāi)始光照培養(yǎng)。當(dāng)觀察到大米培養(yǎng)基上出現(xiàn)橙黃色的微小菌蕾時(shí)，培養(yǎng)瓶蓋換成可透氣的瓶蓋，在光照條件下可見(jiàn)子實(shí)體的逐漸長(zhǎng)大。

1.2.2 總RNA的提取與cDNA第1鏈的合成 蛹蟲(chóng)草在固體PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，長(zhǎng)出菌絲體后置于-80 ℃。取0.05～0.10 g樣品在預(yù)冷的研鼴中充分研磨，迅速加入1 mL TRIzol試劑，采用氯仿去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，異丙醇沉淀和75%酒精洗滌等步驟，干燥后融于無(wú)RNase的去離子水中，即為提取的總RNA。用Recombinant DNase I進(jìn)行處理，以去除樣品的DNA。采用cDNA合成試劑盒和Oligo(dT)18引物合成cDNA第1鏈，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3Cmwc-1a和Cmwc-2b的克隆和測(cè)序 在NCBI上搜索到藍(lán)光受體基因Cmwc-1(GenBank序列號(hào)：JX845417.1)以及藍(lán)光受體基因Cmwc-2 (GenBank序列號(hào)：JX852619.1)[34]，截取基因Cmwc-1 ORF其中的1 549～2 772 bp片段(標(biāo)記為Cmwc-1a)和基因Cmwc-2 ORF其中的394～1 179 bp片段(標(biāo)記為Cmwc-2b)分別用以原核表達(dá)。利用軟件Primer 5.0或Oligo 6.0設(shè)計(jì)序列Cmwc-1a和序列Cmwc-2b進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物，同時(shí)在相應(yīng)引物上引入酶切位點(diǎn)(表1)。以WC-1a和WC-1b、WC-2a和WC-2b為引物對(duì)，以2 μL 反轉(zhuǎn)錄合成的第1鏈cDNA產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得Cmwc-1a和Cmwc-2b。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，其程序?yàn)橄?4 ℃預(yù)變性3 min；隨后 94 ℃變性40 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，此3步驟共30個(gè)循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物，克隆到pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 用于原核表達(dá)的相關(guān)引物Tab.1 A list of primers used in this study

注：GGTACC為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)。

Note：GGTACC is the digestion site of restriction enzymeKpnⅠ，AAGCTT is the digestion site of restriction enzymeHind Ⅲ.

1.2.4Cmwc-1a和Cmwc-2b的表達(dá)和重組蛋白純化 克隆到pMD18-T載體上的Cmwc-1a和Cmwc-2b經(jīng)測(cè)序正確以后，分別經(jīng)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，而后分別連接到同樣經(jīng)過(guò)KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切的pET-41a(+)載體上，構(gòu)建表達(dá)載體pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)中。超聲波破碎經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)的重組菌，離心后收集上清和沉淀，分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。用ProteinIsoTMNi-NTA Resin蛋白質(zhì)純化柱純化表達(dá)蛋白，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用SDS-PAGE分析純化后的表達(dá)。

1.2.5 抗體制備 純化獲得的原核表達(dá)蛋白質(zhì)作為抗原免疫家兔，制備抗體anti-WC-1A和anti-WC-2B。具體方法為：抗原加入福氏完全佐劑，家兔頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫雄性純種新西蘭大白兔(體重2.5～3.0 kg)，每隔14 d 免疫1次，共免疫5～6次，每種抗原均免疫2只新西蘭大白兔。免疫結(jié)束后采血并收集血清。獲得的抗血清經(jīng)Protein A親和層析柱純化，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 Western Blotting 取樣的蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體均保存在-80 ℃。檢測(cè)時(shí)，將0.2 g菌絲體或子實(shí)體置于預(yù)冷的研鼴中研磨，研磨的粉末收集在1.5 mL離心管中，用帶有蛋白酶抑制劑的pH值7.4的PBS緩沖液1 mL懸浮，渦旋2 min，4 ℃浸提4 h或過(guò)夜。而后12 000 r/min離心10 min，上清液即為蛋白質(zhì)樣品。該樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于封閉液(5%脫脂奶粉)中孵育2 h，用PBST(pH值7.4的PBS加入0.1% Tween-20)洗滌3次，每次10 min。將膜在一抗中4 ℃孵育過(guò)夜，再用PBST洗膜3次后，加羊抗兔二抗IgG-HRP共同孵育1 h，PBST洗滌3次，然后用DAB試劑顯色，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲(chóng)草總RNA提取

培養(yǎng)獲得的蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體取樣后迅速冰凍在-80 ℃，以保證每次取樣樣品的新鮮度。將獲得的蛹蟲(chóng)草樣品直接進(jìn)行總RNA的抽提，從圖1中可以看出，所獲得的總RNA有2條清晰的28S和18S條帶，從菌絲體和子實(shí)體中均獲得較好的總RNA提取結(jié)果，均可用于cDNA第1鏈的合成。

圖1 蛹蟲(chóng)草菌絲體(A)和子實(shí)體(B)中提取的總RNAFig.1 Total RNA extraceted from the mycelia (A)and fruiting body (B) of Cordyceps militaris

2.2 Cmwc-1a和Cmwc-2b的RT-PCR擴(kuò)增

提取獲得的總RNA用DNA酶處理以去除其中的DNA，再反轉(zhuǎn)錄可得到cDNA。Cmwc-1a和Cmwc-2b片段的RT-PCR擴(kuò)增使用相應(yīng)的引物(表1)進(jìn)行，獲得預(yù)計(jì)大小的DNA片段。將擴(kuò)增獲得的DNA片段連接克隆載體pMD18-T后，進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果Cmwc-1a片段長(zhǎng)度為1 224 bp ，Cmwc-2b片段長(zhǎng)度為786 bp(圖2)。

M.DNA Marker DL2000。

2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

用KpnⅠ和Hind Ⅲ將構(gòu)建于克隆載體中的Cmwc-1a進(jìn)行雙酶切并回收，插入同樣雙酶切的表達(dá)載體pET-41a(+)中，獲得重組質(zhì)粒pET-41a-Cmwc-1a；同樣用KpnⅠ和Hind Ⅲ將克隆載體中的Cmwc-2b進(jìn)行雙酶切并進(jìn)行回收，插入pET-41a(+)中，獲得重組質(zhì)粒pET-41a-Cmwc-2b。表達(dá)載體pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α菌株中。為了驗(yàn)證這2個(gè)表達(dá)載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性，一方面進(jìn)行DNA測(cè)序分析；另一方面，抽提表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定。結(jié)果測(cè)序獲得了正確的結(jié)果，雙酶切也得到了正確大小的酶切片段(圖3)，表明構(gòu)建的表達(dá)載體符合預(yù)期。

M.DNA Marker DL5000。

2.4 原核表達(dá)蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒pET-41a-Cmwc-1a和pET-41a-Cmwc-2b分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)。工程菌株進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)，而后收集大腸桿菌菌體并進(jìn)行處理，SDS-PAGE分析表達(dá)情況。

帶有pET-41a-Cmwc-1a質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌適于的表達(dá)條件為28 ℃，1.0 mmol/L 的IPTG誘導(dǎo)。在該條件下可出現(xiàn)特異的76 ku融合蛋白(圖4-A泳道2)，經(jīng)超聲波裂解以后離心的沉淀中可見(jiàn)濃度更高的76 ku融合蛋白(圖4-A泳道3)；而未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的重組菌中無(wú)特異的融合蛋白帶(圖4-A泳道1)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)并超聲波裂解后離心的上清液中融合蛋白含量較少(圖4-A泳道4)。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白是以包涵體形式存在。同樣，pET-41a-Cmwc-2b轉(zhuǎn)化菌和pET-41a-Cmwc-1a轉(zhuǎn)化菌的誘導(dǎo)條件和誘導(dǎo)后表達(dá)情況基本相同，這時(shí)表達(dá)的融合蛋白大小為60 ku(圖4-B)。

2.5 重組蛋白的純化

大腸桿菌中重組蛋白CmWC-1A和CmWC-2B的表達(dá)都以包涵體形式，可用6 mol/L的鹽酸胍處理工程菌中得到的包涵體，Ni-NTA親和柱純化重組蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE分析。

用200～500 mmol/L濃度內(nèi)的咪唑液洗脫，可獲得較高濃度的純化原核表達(dá)的重組蛋白CmWC-1A，其中以500 mmol/L洗脫的效果較好，電泳可見(jiàn)有純化程度較好的76 ku融合表達(dá)蛋白(圖5-A泳道6)。以同樣濃度范圍的咪唑液洗脫，也可獲得一定純化程度的CmWC-2B，低濃度(10 mmol/L)和高濃度(500 mmol/L)得到的重組蛋白的純化情況基本相同，可以檢測(cè)到60 ku融合蛋白，但也存在部分雜蛋白帶。因此，一定范圍內(nèi)咪唑液濃度對(duì)Ni-NTA親和層析柱吸附CmWC-2B洗脫影響差異不大(圖5-B泳道3～6)。

M.Protein Marker；1.無(wú)IPTG誘導(dǎo)；2.28 ℃和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)；3.IPTG誘導(dǎo)且超聲波破碎后的沉淀；4.IPTG誘導(dǎo)且超聲波破碎后的上清液。M.Protein Marker；1.Engineering bacteria were not induced by IPTG；2.Engineering bacteria were induced by 1.0 mmol/L IPTG at 28 ℃；3.Precipitatefrom the Ultrasonic breaking engineering bacteria induced by IPTG；4.Supernatant from the Ultrasonic breaking engineering bacteria induced by IPTG.

M.Protein Marker；1，2.6 mol/L的鹽酸胍溶液處理包涵體裂解液；3～6.Ni-NTA親和層析柱上洗脫下來(lái)的CmWC-1A與CmWC-2B(咪唑緩沖液濃度分別為10，50，200，500 mmol/L)。M.Protein Marker；1，2.Lysate of inclusion bodies treated with 6 mol/L guanidine hydrochloride solution；3-6.CmWC-1A and CmWC-2B eluted with 10，50，200，500 mmol/L，respectively.

2.6 抗體的制備

將原核表達(dá)獲得融合蛋白CmWC-1A和CmWC-2B分別進(jìn)行純化，而后分別用這2個(gè)純化的蛋白質(zhì)免疫家兔，可以得到抗體anti-WC-1A和anti-WC-2B(抗體制備均為2次重復(fù)，表2)。獲得的抗體都經(jīng)過(guò)親和層析柱Protein A的純化。ELISA分析anti-WC-1A和anti-WC-2B的效價(jià)，結(jié)果表明，稀釋80 000倍時(shí)，酶標(biāo)儀檢測(cè)ELISA的光吸收值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了空白對(duì)照(免疫前的兔血清)的值(表2)，說(shuō)明獲得的抗體anti-WC-1A和anti-WC-2B有較高的效價(jià)。

表2 ELISA分析anti-WC-1A和anti-WC-2B的效價(jià)Tab.2 ELISA analysis of titer of anti-WC->1A and anti-WC-2B

2.7 CmWC-1在蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中的Western Blotting分析

蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中的藍(lán)光受體蛋白CmWC-1的分析，可以通過(guò)已經(jīng)制備的抗體anti-WC-1A進(jìn)行Western Blotting的蛋白質(zhì)印跡分析。研究過(guò)程中，無(wú)論是菌絲體還是子實(shí)體，每毫升蛋白質(zhì)提取液中均只溶解0.2 g生物量的蛋白質(zhì)。Western Blotting分析表明，在蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中，CmWC-1的表達(dá)存在明顯的差異。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為5，8，13 d時(shí)，蛹蟲(chóng)草菌絲體中可檢測(cè)到2條特異性雜交帶蛋白質(zhì)，分子量約為42 ku的蛋白質(zhì)(命名為CmWC1-42)和分子量為48 ku的蛋白質(zhì)(命名為CmWC1-48)，且表達(dá)量CmWC1-48比CmWC1-42多，同時(shí)CmWC1-48和CmWC1-42在不同時(shí)間的表達(dá)量基本變化不大(圖6-泳道1～3)。接種在培養(yǎng)瓶中的蛹蟲(chóng)草，其菌絲體在培養(yǎng)大約18 d以后可產(chǎn)生子實(shí)體，Western Blotting分析生長(zhǎng)在不同時(shí)間的子實(shí)體中CmWC-1，在培養(yǎng)時(shí)間為20，25，40 d產(chǎn)生的子實(shí)體中只檢測(cè)到42 ku的CmWC1-42，但表達(dá)量顯然比菌絲體中要高很多，而且隨著時(shí)間的推移其表達(dá)量稍有增加(圖6-泳道4～6)。

M.Protein Marker；1～3分別為培養(yǎng)時(shí)間5，8，13 d的菌絲體中的CmWC-1；4～6分別為培養(yǎng)時(shí)間20，25，40 d子實(shí)體中的CmWC-1。M.Protein Marker；1-3.CmWC-1 from the C. militaris mycelium at the 5th，8th and 13th day of inoculation，respectively；4-6.CmWC-1 from the C. militaris fruiting body at the 20th，25th and 40th day of inoculation，respectively.

2.8 CmWC-2在蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中的Western Blotting分析

蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中的鐘蛋白CmWC-2的分析，可以通過(guò)已經(jīng)制備的抗體anti-WC-2B進(jìn)行Western Blotting的蛋白質(zhì)印跡分析。Western Blotting分析表明，CmWC-2在蛹蟲(chóng)草菌絲體和子實(shí)體中均只有一條分子量大小為50 ku的蛋白質(zhì)(命名為CmWC2-50)。通過(guò)Western Blotting分析蛹蟲(chóng)草菌絲體培養(yǎng)5，8，13 d的情況，CmWC2-50量隨時(shí)間推移而減少(圖7-泳道1～3)；而分析接種20，25，40 d后產(chǎn)生的蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中的情況，CmWC2-50的量普遍要比菌絲體中的高，且也有隨時(shí)間的推移表達(dá)量減少的趨勢(shì)(圖7-泳道4～6)。

M.Protein Marker；1～3分別為培養(yǎng)時(shí)間5，8，13 d的菌絲體中的CmWC-2；4～6分別為培養(yǎng)時(shí)間20，25，40 d子實(shí)體中的CmWC-2。M.Protein Marker；1-3. CmWC-2 from the C. militaris mycelium at the 5th，8th and 13th day of inoculation，respectively；4-6.CmWC-2 from the C. militaris fruiting body at the 20th，25th and 40th day of inocula-tion，respectively.

3 討論

本研究通過(guò)克隆Cmwc-1和Cmwc-2基因的部分序列Cmwc-1a和Cmwc-2b，將這2個(gè)序列片段成功構(gòu)建進(jìn)入了原核表達(dá)載體pET-41a(+)中，而后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中并獲得了表達(dá)。從表達(dá)的結(jié)果來(lái)看，均為包涵體融合蛋白，通過(guò)親和層析柱對(duì)這2個(gè)融合蛋白進(jìn)行了純化并獲得了可用于制備藍(lán)光受體蛋白CmWC-1和CmWC-2抗體的融合蛋白。本研究采用原核表達(dá)的方法制備抗原，是目前較常用到的方法，2個(gè)藍(lán)光受體基因均獲得了較好的表達(dá)，為進(jìn)一步的研究提供了可能。將獲得的抗原免疫家兔，獲得了藍(lán)光受體蛋白CmWC-1和CmWC-2抗血清，經(jīng)過(guò)親和層析柱純化獲得了CmWC-1和CmWC-2的多克隆抗體。純化的抗體經(jīng)過(guò)ELISA檢測(cè)，效價(jià)均較高，完全可以用于相關(guān)的蛹蟲(chóng)草中CmWC-1和CmWC-2的研究。

環(huán)境可以影響蛹蟲(chóng)草的發(fā)育，其中光對(duì)蛹蟲(chóng)草的影響已經(jīng)有報(bào)道[34-35，37]。已從蛹蟲(chóng)草中克隆了2個(gè)藍(lán)光受體蛋白基因[34-35]，對(duì)蛹蟲(chóng)草中這2個(gè)藍(lán)光受體蛋白在菌絲體中的短期表達(dá)和子實(shí)體中的表達(dá)進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量分析[20]。在本研究中，制備的CmWC-1和CmWC-2的抗體anti-WC-1A和anti-WC-2B被用于Western Blotting分析，以檢測(cè)蛹蟲(chóng)草中CmWC-1和CmWC-2的存在形式。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，可檢測(cè)到蛹蟲(chóng)草CmWC-1存在CmWC1-48和CmWC1-42 這2種形式，分子量明顯比由基因序列推測(cè)的要小很多(GenBank序列號(hào)：AFU65172.1)；也可檢測(cè)到CmWC-2存在CmWC2-50蛋白質(zhì)，其分子量與基因序列推測(cè)的非常接近(GenBank序列號(hào)：AFZ15762.1)，如果考慮CmWC-2信號(hào)肽序列的切除，正好符合實(shí)際分子量的大小。比較脈孢菌中，WC-1和WC-2蛋白均可進(jìn)行磷酸化且其磷酸位點(diǎn)比較多，WC-1和WC-2的磷酸化程度可影響WCC的功能[38-39]。有研究表明，WCC的轉(zhuǎn)錄因子活性在光照條件下會(huì)增強(qiáng)[40]。進(jìn)一步分析表明WCC磷酸化水平對(duì)轉(zhuǎn)錄因子活性和蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響較大：當(dāng)磷酸化水平低時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子活性高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性低；反之，當(dāng)磷酸化水平高時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子活性低，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性高[41]。由此推測(cè)，蛹蟲(chóng)草中的CmWC-1和CmWC-2形成復(fù)合物時(shí)的穩(wěn)定性也會(huì)受到其磷酸化水平的影響。

CmWC-1在菌絲體中可見(jiàn)有CmWC1-48和CmWC1-42，但以CmWC1-48為主；而子實(shí)體中只可見(jiàn)有CmWC1-42，且含量較菌絲體中更高。產(chǎn)生這種情況的原因目前還不完全清楚，推測(cè)可能是由于菌絲體和子實(shí)體中藍(lán)光受體CmWC-1的作用機(jī)制和磷酸化水平有差異，導(dǎo)致降解機(jī)制不同。而對(duì)菌絲體和子實(shí)體中的CmWC-2進(jìn)行分析，均只能檢測(cè)到CmWC2-50，表明沒(méi)有降解。因此，可以初步形成一個(gè)結(jié)論，CmWC-1和CmWC-2形成復(fù)合物行使生物學(xué)功能后，會(huì)導(dǎo)致CmWC-1的降解，而CmWC-2維持穩(wěn)定的存在，且CmWC-1的降解在菌絲體和子實(shí)體中存在差異。