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    牦牛IGF-IR基因克隆及其序列分析

    2018-09-10 09:51:56梁春年王宏博吳曉云
    華北農(nóng)學(xué)報(bào) 2018年4期
    關(guān)鍵詞:殘基堿基牦牛

    梁春年,王宏博,吳曉云,褚 敏,郭 憲,閻 萍

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所,甘肅 蘭州 730050;2.甘肅省牦牛繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730050)

    胰島素樣生長(zhǎng)因子家族(Insulin-like growth factors,IGFs)由IGF-1、IGF-2、IGF-1R、IGF-2R及IGFBP1~I(xiàn)GFBP6共10個(gè)蛋白因子組成[1],其相互作用調(diào)節(jié)生物學(xué)過程,是胚胎正常發(fā)育和出生后機(jī)體生長(zhǎng)必需的生長(zhǎng)因子[2]。IGF-IR是跨膜酪氨酸激酶成員之一,最初由美國(guó)科學(xué)家Megyesi從小鼠的肝血漿組織分離獲得[3],它可以和IGF-1密切結(jié)合,啟動(dòng)對(duì)配體的生理反應(yīng),也可以和IGF-2松散結(jié)合,在胎兒發(fā)育期間起到促有絲分裂作用[4-5]。IGF-IR蛋白是由2個(gè)α鏈和2個(gè)β鏈通過二硫鍵連接在一起的同型二聚體。對(duì)于IGF1R基因結(jié)構(gòu)、功能以及在信號(hào)通路中作用的研究,在人類醫(yī)學(xué)方面研究較多,在其他動(dòng)物如綿羊、小鼠、雞等中也展開過許多研究[6]。人的IGF-IR基因的cDNA在1986年被克隆并測(cè)序,包含4 989個(gè)核苷酸,編碼1 367個(gè)氨基酸前體蛋白[7]。該蛋白前體包含一個(gè)30個(gè)殘基的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)和在殘基707-710位點(diǎn)的Arg.Lys.Arg.Arg酶切割點(diǎn),切割形成α鏈(殘基1-707)、β鏈(殘基712-1 337)[8],前體蛋白還包含一個(gè)跨膜序列(殘基906-929)和一個(gè)含有酪氨酸激酶的408個(gè)殘基細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域[9]。IGF-IR基因DNA序列全長(zhǎng)約310 kb,包含21個(gè)外顯子,其中α鏈上10個(gè)外顯子,β鏈上11個(gè)外顯子[10]。IGF-IR基因α亞基富含半胱氨酸,具有配體結(jié)合區(qū),主要與IGF-I結(jié)合;β亞基的基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)在胞內(nèi)區(qū)950殘基處,主要與IRS-1、She結(jié)合[11]。研究表明,IGF-IR與多種因子相互作用,對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞凋亡和增殖以及腫瘤細(xì)胞的發(fā)生密切相關(guān)[12-15]。牦牛是適應(yīng)高寒牧區(qū)的獨(dú)特牛種之一,是當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的主導(dǎo)畜種,但是生產(chǎn)性能較低。IGF-IR基因介導(dǎo)IGF發(fā)揮生物學(xué)功能,深入開展牦牛IGF-IR基因的結(jié)構(gòu)和功能研究,可為該基因功能挖掘利用及篩查基因多態(tài)性和牦牛生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析等提供研究基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1.1.1 樣品采集 大通牦牛背最長(zhǎng)肌采集于青海省大通牛場(chǎng)屠宰場(chǎng)。用干凈刀片切取新鮮肌肉樣品,分裝,10 g/份,立即投入液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

    1.1.2 試劑 RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA Marker、LATaqDNA聚合酶、膠回收試劑盒和pGME-T Easy Vector Systems均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司??俁NA提取試劑盒和JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自蘭州天根生物有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 牦牛肌肉總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照總RNA提取試劑盒提取牦牛肌肉組織總RNA,瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA完整性。以牦牛肌肉總RNA為模板,采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中登陸的黃牛IGF-IR基因序列信息(登錄號(hào)為NM_001244612),與其他物種IGF-IR基因序列進(jìn)行比對(duì),選擇保守區(qū),設(shè)計(jì)牦牛IGF-IR基因擴(kuò)增引物。擴(kuò)增引物見表1。

    表1 設(shè)計(jì)的引物序列信息Tab.1 Sequence and information of primers for yak IGF IR

    1.2.2 牦牛IGF-IR基因分段擴(kuò)增及鑒定 PCR反應(yīng)體系(50 μL):10×PCR Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol/L)2 μL,cDNA模板 2.5 μL,上下游引物各3 μL(20 μmol/L),LATaqDNA聚合酶2.5 μL,無菌蒸餾水32 μL,混勻。

    PCR反應(yīng)條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s,退火30 s(退火溫度見表1),65 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);65 ℃ 10 min。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物,凝膠回收純化目的片段,連接至pGME-T Easy載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞,通過菌液PCR及雙酶切鑒定陽性克隆,送上海生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。利用DNAStar和SeqMan軟件進(jìn)行目的基因序列拼接。

    1.2.3 牦牛IGF-IR基因生物信息學(xué)分析 利用DNAman、DNAStar、ClustalX 及MEGA 4等生物信息學(xué)軟件,結(jié)合有關(guān)基因和蛋白序列、結(jié)構(gòu)信息分析的各種在線工具,對(duì)牦牛IGF-IR基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。預(yù)測(cè)該基因序列特征、編碼蛋白質(zhì)的理化特性及功能域等。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用Sopma(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)和SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析進(jìn)行;跨膜結(jié)構(gòu)分析通過TMHMM Server v. 2.0和TMpre(http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)進(jìn)行;SignalP 3.0 Server分析信號(hào)肽。采用ClustalX 及MEGA 4進(jìn)行序列比對(duì),構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 RNA的檢測(cè)

    利用總RNA提取試劑盒提取牦牛肌肉組織總RNA,經(jīng)0.8%的凝膠電泳檢測(cè)。從圖1可以看出,有3條清晰的條帶,分別為28S、18S和5S,條帶邊界清晰,表明提取的總RNA質(zhì)量完好,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

    圖1 牦牛肌肉組織總RNA的電泳圖譜Fig.1 Gel electrophoresis for total RNA of yak muscle

    2.2 牦牛IGF-IR基因分段PCR分析

    根據(jù)表1中設(shè)計(jì)的引物,以牦牛肌肉cDNA為模板,特異性擴(kuò)增獲得IGF-IR基因各片段;各片段擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為419,1 222,1 778,1 507 bp,與預(yù)期片段大小相符(圖2)。

    M.DNA Marker;2和3.引物1擴(kuò)增產(chǎn)物;4.引物2擴(kuò)增產(chǎn)物;5.引物4擴(kuò)增產(chǎn)物;6.引物3擴(kuò)增產(chǎn)物。M.DNA Marker;2 and 3.Amplified product by primer 1;4.Amplified product by primer 2;5.Amplified product by primer 4;6.Amplified product by primer 3.

    2.3 牦牛IGF-IR基因序列分析

    測(cè)序結(jié)果表明,牦牛IGF-IR基因ORF長(zhǎng)約4 104 bp,編碼1 367個(gè)氨基酸;理論分子量約154.95 ku,等電點(diǎn)pI值約5.71。亮氨酸的含量最高,達(dá)到8.3%,谷氨酸次之,為8.2%。該基因編碼的蛋白含有179個(gè)帶正電荷殘基,174個(gè)帶負(fù)電荷的殘基,蛋白水溶液在280 nm處的消光系數(shù)約210 630,不穩(wěn)定系數(shù)是48.20,蛋白穩(wěn)定性較低,平均親水系數(shù)是0.402。與黃牛IGF-IR基因(GenBank登錄號(hào):NM_001244612)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),牦牛IGF-IR基因共有20處發(fā)生堿基改變,其中,G到T堿基顛換2次,G到A堿基轉(zhuǎn)換2次,C到T堿基轉(zhuǎn)換7次,A到G堿基轉(zhuǎn)換3次,T到C堿基轉(zhuǎn)換6次。

    2.4 牦牛IGF-IR基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

    根據(jù)Blast同源搜素結(jié)果,將牦牛IGF-IR氨基酸序列與GenBank登陸的黃牛、豬、人、狗、小鼠、雞、猩猩等7個(gè)物種IGF-IR氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明,牦牛IGF-IR基因編碼區(qū)發(fā)生9個(gè)堿基變異,造成3個(gè)氨基酸改變,即第6位由精氨酸(Arg)代替甘氨酸(Gly),第29位由異亮氨酸(Ile)代替蘇氨酸(Thr),第30位由異亮氨酸(Ile)代替絲氨酸(Ser)(圖3)。在比較的8個(gè)物種中,牦牛與黃牛IGF-IR氨基酸序列間相似性最高,達(dá)到99.8%,與雞的相似性最低,僅為82.3%(表2)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明(圖4),牦牛IGF-IR與黃牛IGF-IR聚為一類,猩猩和人的IGF-IR聚為一類后,再與豬IGF-IR等共同聚為一大類,最后與雞IGF-IR聚為一類,這與生物進(jìn)化的歷程相一致,說明IGF-IR相對(duì)比較保守性,對(duì)生物的進(jìn)化起到重要作用。

    2.5 牦牛IGF-IR二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析

    SOPMA預(yù)測(cè)結(jié)果表明,牦牛IGF-IR蛋白中α-螺旋占26.12%,β-折疊占20.92%,β-轉(zhuǎn)角占4.61%,隨機(jī)卷曲占48.35%。TMHMM Server v.2.0分析顯示牦牛IGF-IR蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu)(圖5),分別位于6-26位,938-958位,1 188-1 209位氨基酸,理論值分別為1 794,3 264和1 068,顯著高于閾值(500)。利用SignalP-NN和SignalP-HMM軟件預(yù)測(cè)表明,IGF-IR蛋白具有信號(hào)肽序列(圖6),位于30-31位氨基酸之間最有可能存在剪切位點(diǎn)。SMART分析表明,牦牛IGF-IR具有IGF受體蛋白特征性結(jié)構(gòu)域(圖7),包括1個(gè)酪氨酸蛋白激酶區(qū)(Tyrkc,999-1 266),3個(gè)纖連蛋白型結(jié)構(gòu)域(FN3,489-914),1個(gè)跨膜區(qū)(936-958)和1個(gè)半胱氨酸富集區(qū)(FU,227-270)。

    2.6 牦牛IGF-IR三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

    將牦牛IGF-IR氨基酸序列提交至蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫用同源建模的方法得到985-1 286位氨基酸的序列,比對(duì)顯示牦牛IGF-IR氨基酸序列與人的該序列(PDB ID 3nw5A)相似性達(dá)到98.68%,其預(yù)期模型精度為2.14 A?,E-Value為2.32e-180,以3nw5A序列為同源建模模板獲得牦牛IGF-IR基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)[16](圖8)。利用Protfun在線分析軟件對(duì)牦牛IGF-IR基因編碼蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)表明,該蛋白具有受體功能的可能性為0.327,具有細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的可能性為0.329,因此,牦牛IGF-IR基因可能主要作為受體在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。

    圖3 不同物種間IGF-IR氨基酸序列比較Fig.3 Alignment of amino-acid sequences of IGF-IR between different species

    表2 牦牛與部分物種間 IGF-IR基因編碼區(qū)氨基酸序列相似性Tab.2 Aligment report of the IGF-IR protin between yak and 7 species

    圖4 不同物種IGF-IR蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of the predicted amino acid sequence of IGF-IR from different specises

    圖5 牦牛 IGF-IR 基因編碼的蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.5 The transmembrane analysis of yak IGF-IR gene

    圖6 IGF-IR蛋白具有信號(hào)肽序列Fig.6 The signal peptide analysis of yak IGF-IR

    圖7 牦牛IGF-IR結(jié)構(gòu)域分析Fig.7 Analysis of domain for yak IGF-IR

    胰島素樣生長(zhǎng)因子是動(dòng)物生長(zhǎng)軸上重要的生長(zhǎng)因子之一,對(duì)動(dòng)物的生產(chǎn)性能、體態(tài)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用,而IGF-1R作為IGF的受體,在胎兒期和出生后的各種組織中廣泛的表達(dá),是IGF在機(jī)體生命過程中發(fā)揮作用的主要介導(dǎo)者[17-18]。目前的研究證明,動(dòng)物IGF-IR基因相對(duì)比較保守。張金玉等[19]在草原紅牛IGF-IR基因3′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)多態(tài)位點(diǎn)。Akis等[20]對(duì)安那托利亞紅牛IGF-IR基因的研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)TaqⅠ酶切多態(tài)位點(diǎn)。

    本研究通過分段克隆牦牛IGF-IR基因編碼區(qū),將拼接獲得的序列與黃牛的IGF-IR基因進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)共有20處發(fā)生堿基改變。對(duì)比牦牛與黃牛IGF-IR氨基酸序列,相似性為99.8%,僅第6位由精氨酸(Arg)代替甘氨酸(Gly),第29位由異亮氨酸(Ile)代替蘇氨酸(Thr),第30位由異亮氨酸(Ile)代替絲氨酸(Ser)。牦牛與豬、人、狗、小鼠、猩猩等物種IGF-IR氨基酸相似性均大于92%,但與雞的相似性較低,僅為82.3%。在本研究比較的8個(gè)物種中核苷酸和氨基酸水平的變異來看,各物種間氨基酸水平的變異程度要明顯小于核苷酸水平的變異。這可能是由于牦牛與各物種在核苷酸水平上的多數(shù)堿基替代或轉(zhuǎn)換并沒有引起編碼氨基酸的改變,屬于同義突變。因此,筆者認(rèn)為,牦牛作為一個(gè)較為原始的牛種,與黃牛及其他物種在核苷酸和氨基酸水平的這種保守型和差異性,正好說明牦牛與其他物種間的分化和物種的形成歷史,這種基因的差異可用于物種系統(tǒng)進(jìn)化的研究?;贗GF-IR基因編碼區(qū)氨基酸序列聚類分析結(jié)果表明,牦牛IGF-IR與黃牛IGF-IR聚為一類,猩猩和人的IGF-IR聚為一類后,再與豬IGF-IR等共同聚為一大類,最后與雞IGF-IR聚為一類,這與生物進(jìn)化的歷程相一致,說明該基因相對(duì)比較保守性,對(duì)生物的進(jìn)化起到重要的作用[21]。

    本研究還利用生物信息學(xué)分析工具對(duì)牦牛IGF-IR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。牦牛IGF-IR蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及隨機(jī)卷曲為主,蛋白存在跨膜結(jié)構(gòu),分布于6-26位,938-958位和1 188-1 209位氨基酸位點(diǎn),且該蛋白具有信號(hào)肽序列,最可能的剪切位點(diǎn)位于30-31位氨基酸,說明IGF-IR蛋白可能在跨膜運(yùn)輸中起信號(hào)識(shí)別作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究該基因的結(jié)構(gòu)和功能及用于牦牛分子育種打下了良好基礎(chǔ)。

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