杏樹李痘病毒病的快速分子檢測(cè)和抗PPV連鎖標(biāo)記的篩選

張俊環(huán)，孫浩元，Boris Kr?ka，楊 麗，姜鳳超，張美玲，王玉柱

(1. 北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京 100093；2.孟德爾大學(xué) 園藝學(xué)院，布爾諾 69144)

李痘病毒(Plumpoxvirus，PPV)病是桃、杏、李、櫻桃等核果類果樹最危險(xiǎn)的病害之一。PPV侵染后，葉片和果實(shí)表現(xiàn)出明顯癥狀，葉片出現(xiàn)褪綠壞死斑，果實(shí)出現(xiàn)環(huán)斑或嚴(yán)重變形并在成熟前落果，嚴(yán)重時(shí)則全樹死亡，引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，在易感品種中損失可高達(dá)80%[1-2]。PPV病最先于1915年在保加利亞發(fā)現(xiàn)，之后在整個(gè)歐美地區(qū)廣泛流行，嚴(yán)重限制了歐美地區(qū)核果類果樹的發(fā)展[3-4]，2009年日本也發(fā)現(xiàn)了PPV的發(fā)生[5]。李痘病毒可經(jīng)蚜蟲傳播，擴(kuò)散速度快，在短時(shí)間內(nèi)即可能給全國(guó)整個(gè)核果類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來災(zāi)難性后果。病害的嚴(yán)重性在很大程度上取決于寄主是感病還是耐病品種，因此，國(guó)外核果類果樹學(xué)者一直致力于抗PPV品種的選育研究，2007年歐盟國(guó)家啟動(dòng)了杏的抗PPV育種計(jì)劃(FP7-KBBE-2007-1)，在分子輔助育種方面做了大量研究，主要是進(jìn)行抗PPV連鎖標(biāo)記的篩選。2002年，Hurtado等[6]抗/感分離群體構(gòu)建杏遺傳圖譜，并最終將抗PPV連鎖標(biāo)記定位到了第一連鎖群的上端。2012年，Soriano等[7]將抗PPV基因的定位區(qū)間進(jìn)一步縮小，并篩選出3個(gè)SSR連鎖標(biāo)記，但后來Decroocq等[8]對(duì)這3個(gè)標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)并不能有效地用于輔助選擇。近期有研究報(bào)道通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行杏、李、桃等核果類果樹PPV抗性基因的篩選[9-12]。但直到如今，仍尚未發(fā)現(xiàn)能夠有效控制PPV的措施；一旦果樹感病，只能立即砍樹，進(jìn)行清園處理。

目前，中國(guó)還沒有發(fā)現(xiàn)核果類果樹感染PPV的報(bào)道，但不能完全保證無帶毒植株的存在，因?yàn)镻PV與李屬壞死環(huán)斑病毒等所引起的癥狀十分相似，并且感病初期植株的表型癥狀不明顯，很難用肉眼觀察區(qū)分[13]。另一方面，這也表明了我國(guó)本土的杏、李資源或許存在抗PPV基因，國(guó)外鑒定的杏抗PPV品種的抗性基因多來源于中國(guó)杏品種資源[14]。抑或是病毒還沒有傳播進(jìn)我國(guó)的杏、李產(chǎn)區(qū)，但是，隨著近些年國(guó)內(nèi)外資源的頻繁交流，每年從國(guó)外輸入中國(guó)的李屬果樹砧木、果實(shí)及種子的數(shù)量較大，其中不能完全排除攜帶PPV的可能。由于種子、砧木等植物材料中PPV濃度很低，檢測(cè)難度較大，容易出現(xiàn)漏檢和假陰性的情況，導(dǎo)致PPV傳入的可能性較大，同時(shí)有些引進(jìn)品種是PPV易感材料，如從國(guó)外引進(jìn)的易于扦插生根的杏砧木Myrabalan，增加了PPV傳入的風(fēng)險(xiǎn)。由此可見，我國(guó)現(xiàn)已處于PPV傳播或感染的危險(xiǎn)境地。因此，一方面迫切需要建立起特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速高效的檢測(cè)技術(shù)，以有效防止PPV的入侵，控制PPV這一病毒在我國(guó)杏、李產(chǎn)區(qū)的流行發(fā)展；另一方面需要利用已有的優(yōu)勢(shì)資源，著手尋找抗PPV資源。本研究在比較確定杏樹PPV病毒感染的分子快速鑒定方法的同時(shí)，利用捷克孟德爾大學(xué)園藝學(xué)院Boris教授構(gòu)建的杏PPV抗性分離的F1群體，篩選與PPV抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，并進(jìn)一步篩選我國(guó)杏資源中存在的PPV抗性材料，以期為抗PPV基因的挖掘研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以抗PPV的2個(gè)杏品種Harlayne和Betinka[15]為親本材料進(jìn)行雜交，獲得PPV抗性分離的F1群體。2015年4月在杏樹展葉期從捷克孟德爾大學(xué)的杏園采集F1群體及其親本的葉片，從北京林業(yè)果樹科學(xué)研究院杏、李資源圃采集新鮮的杏、李資源(表1)的嫩葉，液氮速凍后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(離心柱型)的方法提取葉片材料的總RNA。試劑盒(Cat.# DP441)購自天根生化科技(北京)有限公司。

表1 供試的杏、李品種Tab.1 Cultivarnames of tested materials including apricot plum

注：1～8為引進(jìn)的杏和李資源；9～53為國(guó)內(nèi)杏品種。

Note：1-8 were introduced cultivars of apricot or plum；9-53 were domestic apricot cultivars.

1.3 RT-PCR法檢測(cè)PPV

cDNA的制備：以總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照Thermo_Scientic Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的說明進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄體系為45 μL。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽性對(duì)照為攜帶PPV病毒基因的質(zhì)粒(由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保所李世訪研究員實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。擴(kuò)增體系為20 μL：10×Buffer 2 μL、25 mmol/L Mg2+1.6 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、上下游引物各0.4 μL、模板cDNA 1 μL和0.5 U/μLTaq酶0.2 μL，ddH2O 14 μL。PPV基因的擴(kuò)增引物序列為F：5′-CAGACTACAGCCTCGCCAGA-3′，R：5′-ACCGAGACCACTACACTCCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為243 bp[16]。RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，然后以94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)程序在MyCyclerTMthermal cycler(Bio-Rad Laboratories，Inc.，USA)PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并在凝膠分析系統(tǒng)下觀察、照相。

1.4 熒光定量法檢測(cè)PPV

采用伯樂的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)試劑盒，實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR反應(yīng)體系為10 μL體系：2×Premix 5 μL、PPV通用引物(同1.3)各1 μL、ddH2O 2 μL、cDNA模板1 μL，以杏Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，其引物序列為F：5′-ACATTGTTCTTAGTGGTGGGTC-3′，R：5′-AGATTCGTCATACTCTGCCTTT-3′[17]。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，均以ddH2O作為模板的空白對(duì)照。用Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，65 ℃延伸5 s，循環(huán)39次。循環(huán)后設(shè)置在55～95 ℃每提高1 ℃時(shí)讀取熒光值并生成溶解曲線?；蛳鄬?duì)表達(dá)量的計(jì)算，參考Livak等[18]的方法，以2-ΔΔCT表示，ΔΔCT=樣本CT值的平均數(shù)-內(nèi)參CT值的平均值。

1.5 DNA提取

按照高效植物基因組DNA提取試劑盒(Cat.# DP350)的方法提取葉片材料的總DNA。試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.6 抗PPV對(duì)等基因池的建立

采用BSA(Bulked Segregation Analysis)法，即根據(jù)F1性狀鑒定的結(jié)果，將雜交群體分成2組，1個(gè)高抗組，1個(gè)易感組，每組5株，將這2組的DNA分別進(jìn)行等量混合，組成對(duì)等基因池。

1.7 SSR分析

SSR-PCR反應(yīng)體系參照Zhang等[19]的方法。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，然后置于4 ℃待電泳檢測(cè)。選用的SSR引物是已經(jīng)利用杏材料篩選出的多態(tài)性較好的引物，包括Decroocq等[8]研究中抗PPV基因QTL定位區(qū)間的SSR位點(diǎn)。所有擴(kuò)增產(chǎn)物采用0.6%聚丙烯酰胺凝膠電泳與銀染法檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏樹感染PPV快速檢測(cè)方法的建立

2.1.1 RNA提取 對(duì)從捷克采回的2份感病杏葉片材料(C-1、C-2)和資源圃的8份引進(jìn)資源材料(2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S)進(jìn)行了總RNA的提取以及RNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)。如圖1所示，提取的總RNA中，基因組DNA已完全去除，而且28S和18S核糖體RNA條帶非常明顯；RNA質(zhì)量和濃度的檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣品的RNA濃度在86～220 ng/μL，OD260/280比值介于1.8～2.1，能夠滿足后續(xù)RT-PCR和熒光定量PCR試驗(yàn)的要求。

M.Marker；泳道1～10對(duì)應(yīng)的杏樣品編號(hào)：2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S、C-1、C-2。M.Marker；The numbers of apricot samples in the lanes 1-10 were 2-1，25-26，25-29，25-32，25-35，25-39，23-38，157/3S，C-1，C-2.

2.1.2 RT-PCR快速檢測(cè)PPV 在優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，篩查引進(jìn)的8份杏資源材料是否感染PPV。從圖2可知，這8份引進(jìn)材料均未擴(kuò)增出目的條帶(243 bp)，只有陽性對(duì)照樣品擴(kuò)出了此條帶。表明8個(gè)引進(jìn)的杏樣品均不攜帶PPV。

M.Marker；泳道1～8對(duì)應(yīng)的杏樣品編號(hào)：2-1、25-26、25-29、25-32、25-35、25-39、23-38、157/3S；PC.陽性對(duì)照；NC.陰性對(duì)照。M.Marker；The numbers of apricot samples in the lanes 1-8 were 2-1，25-26，25-29，25-32，25-35，25-39，23-38，157/3S；PC.Positive control；NC.Negative control.

2.1.3 qRT-PCR熒光定量分析 為了進(jìn)一步檢驗(yàn)RT-PCR方法的可靠性和材料是否帶毒的確定性，對(duì)8份材料和2份已知感病的對(duì)照材料進(jìn)行了高特異、高敏感性的熒光定量PCR分析。由圖3-A、B可知，內(nèi)參基因和目的基因的指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期均十分明顯，而且內(nèi)參基因和目的基因的溶解曲線均呈單峰型，證明擴(kuò)增的特異性較好?？梢愿鶕?jù)樣品的CT值計(jì)算出目的基因的相對(duì)表達(dá)量。由圖3-C可以看出，8個(gè)杏樣本中均未檢測(cè)出PPV基因的表達(dá)，而在對(duì)照的2個(gè)帶毒樣本C-1和C-2中，這一基因的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)58 734.39和184 478.25。熒光定量檢測(cè)結(jié)果與2.1建立的RT-PCR快速檢測(cè)方法對(duì)8個(gè)杏樣本的檢測(cè)結(jié)果完全一致，證明了所建立的RT-PCR快速檢測(cè)體系是高效、可靠的。

A.基因擴(kuò)增曲線；B.溶解曲線；C.PVV基因相對(duì)表達(dá)量；ND.未檢測(cè)到。A.Amplification plot；B.Melt curve plot；C.Relative expression of PVV gene; ND.No detected.

2.2 群體表型性狀的鑒定和取樣

2013年7月捷克孟德爾大學(xué)園藝學(xué)院Boris實(shí)驗(yàn)室利用2個(gè)抗PPV的杏品種Harlayne和Betinka作親本進(jìn)行雜交，獲得了近200株的F1分離群體。2014年對(duì)群體單株的抗病性進(jìn)行生物學(xué)鑒定。2015年7月從捷克采回F1分離群體的葉片樣品100份，包括34份抗病個(gè)體、34份易感個(gè)體和32份耐病個(gè)體。

2.3 PPV抗/感性狀連鎖標(biāo)記的篩選

2.3.1 群體DNA樣本的制備 對(duì)100份F1分離群體及其2個(gè)親本的樣本基因組DNA進(jìn)行提取與DNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)，全部樣品的OD260/280在1.8～2.0，樣品的濃度均大于100 ng/μL，總量均大于10 μg；DNA電泳結(jié)果顯示：所有樣品主帶清晰，樣品無RNA污染，個(gè)別樣品有蛋白質(zhì)污染，但不影響后續(xù)試驗(yàn)；因此，樣品的純度、濃度與總量均能較好地保證后續(xù)的SSR分子標(biāo)記試驗(yàn)。圖4顯示了部分樣品的DNA瓊脂糖電泳結(jié)果。

2.3.2 SSR引物的親本間篩選以及在抗病/感病對(duì)等基因池間的篩選 用11對(duì)SSR引物同時(shí)在親本Betinka和Harlayne，以及抗病混合池和感病混合池間之間進(jìn)行篩選，所有的引物均能夠擴(kuò)增出清晰條帶，占總引物數(shù)的100%，其中有6對(duì)引物能夠同時(shí)在親本間以及抗病混合池和感病混合池間擴(kuò)增出相同的差異條帶，占總引物數(shù)的54.5%，這6條多態(tài)性引物序列見表2。圖5顯示了11對(duì)引物在兩親本間以及抗病/感病混合池間的擴(kuò)增結(jié)果。

圖4 部分F1個(gè)體的DNA提取結(jié)果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of DNA samplesextracted from F1 population inapricot

表2 親本和對(duì)等基因池間多態(tài)性一致的引物Tab.2 The polymorphic primers between two parents and two DNA bulks

11對(duì)引物分別為PGS1.24、PGS1.23、PGS1.21、PaCTA17、Pchcms4、UDP96-005、PaCITA5、UDA-025、UDAp-414、Pchgms4和CPPCT27；相鄰的4個(gè)泳道是一對(duì)引物；篩選樣品分別為抗病基因池、感病基因池、抗性親本Betinka和易感親本Harlayne。The eleven pairs of primers including PGS1.24，PGS1.23，PGS1.21，PaCTA17，Pchcms4，UDP96-005，PaCITA5，UDA-025，UDAp-414，Pchgms4 and CPPCT27；The primers in adjacent four lanes were the same；The samples for screening were resistance gene pool，susceptible gene pool，resistance parent Betinka and susceptible parent Harlayne，respectively.圖5 11對(duì)引物在2個(gè)對(duì)等基因池間和2個(gè)親本間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 The profile of 11 SSR loci amplification in the two parents and two DNA bulks

2.3.3 抗病/感病對(duì)等基因池間多態(tài)性引物在部分分離群體間的復(fù)選 用對(duì)等基因池和親本間相同的多態(tài)性引物繼續(xù)在親本和46個(gè)分離群體間進(jìn)行復(fù)選，46個(gè)分離群體根據(jù)表型(PPV抗性)不同分為3組：抗病群體(R)、耐病群體(T)和易感群體(S)，3類群體分別選用的后代個(gè)體數(shù)量為16，12，18個(gè)。結(jié)果如圖6所示，6對(duì)引物中只有1對(duì)引物(PGS1.23)在后代的分離群體中擴(kuò)增出有規(guī)律的多態(tài)性條帶。在PGS1.23擴(kuò)增出的差異帶中，條帶a在大多易感后代和親本Betinka中出現(xiàn)，而在F1群體的大多數(shù)抗性個(gè)體(R)中未出現(xiàn)，說明該條帶可能與易感性狀相關(guān)；條帶b抗性后代和抗性親本Harlayne中出現(xiàn)，而在多數(shù)易感后代中沒有出現(xiàn)，說明該條帶可能與杏的PPV抗性性狀有連鎖。

2.3.4 連鎖標(biāo)記在分離群體的驗(yàn)證 在F1分離的極端群體(易感和高抗)和兩親本間對(duì)篩選出的連鎖標(biāo)記PGS1.23進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖7。PGS1.23在19個(gè)易感后代(S1～S19)中有15個(gè)擴(kuò)增出了片段a，在18個(gè)高抗(R1～R18)后代中有14個(gè)擴(kuò)增出了片段b，此標(biāo)記檢測(cè)分離群體PPV抗性的符合度達(dá)到了78.3%，基本可用于PPV抗性的輔助選擇。PPV抗性是一個(gè)多基因控制的性狀，今后還需要進(jìn)一步尋找其他連鎖程度更高的分子標(biāo)記，以更好地應(yīng)用于PPV抗性育種過程中的早期輔助選擇。

M.Marker；S1～S19.PPV易感個(gè)體；T1～T12.PPV耐病個(gè)體；R1～R18.PPV抗性個(gè)體；B.Betinka；H.Harlayne；a和b是特異條帶。圖7同。M.Marker；S1-S19.PPV-susceptible progeny；T1-T12.PPV-tolerant progeny；R1-R18.PPV-resistant progeny；B.Betinka；H.Harlayne；a，b.The special bands.The same as Fig.7.

圖7 連鎖標(biāo)記PGS1.23在易感抗病F1群體和親本間的擴(kuò)增結(jié)果Fig.7 The amplification profile of the linkage marker PGS1.23intwo parents and F 1 individuals

2.4 抗PPV資源的篩選

利用篩選到的連鎖標(biāo)記對(duì)本課題組資源圃保存的杏資源進(jìn)行PPV高抗資源的篩選，以期建立我國(guó)抗PPV的杏資源名錄。如圖8所示，菜籽黃、楊繼元、垂枝山杏、大早熟和媳婦杏具有抗性品種Harlayne和Betinka的擴(kuò)增片段b，其中菜籽黃、楊繼元、媳婦杏與Harlayne的擴(kuò)增結(jié)果基本一致。篩選出的抗PPV資源，為進(jìn)一步挖掘抗PPV的基因提供了材料基礎(chǔ)，也可作為親本用于抗PPV品種的選育研究。

圖8 連鎖標(biāo)記PGS1 23對(duì)45份中國(guó)杏資源和2個(gè)參照品種Betinka和Harlayne的擴(kuò)增結(jié)果Fig.8 The profile of SSR amplification of the linkage marker PGS1.23in45Chinaapricotcultivarsandtwo control cultivars Betinka and Harlayne

3 討論

目前檢測(cè)PPV的常用方法有酶聯(lián)免疫ELISA、普通RT-PCR、多重PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)等。相對(duì)于ELISA方法，PCR方法更加高效和靈敏。Wetzel等[16]于1991年建立了普通RT-PCR檢測(cè)PPV的方法，根據(jù)病毒基因序列設(shè)計(jì)出引物，用此引物在感染PPV的材料中均能檢測(cè)到243 bp的擴(kuò)增片段，后來PPV的PCR檢測(cè)方法中均以是否擴(kuò)增出這一特異的片段為判斷標(biāo)準(zhǔn)[20]。本研究結(jié)果表明：熒光定量PCR和普通RT-PCR方法均能快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)PPV病毒是否存在，但普通的RT-PCR檢測(cè)方法更加簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，所以可優(yōu)先選用RT-PCR方法對(duì)杏、李等核果類果樹PPV病毒病進(jìn)行快速檢測(cè)。通常使用的植物材料、試劑及設(shè)備不同時(shí)，所用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件也有所不同。本研究針對(duì)杏葉片材料和所使用的試劑盒材料，建立了杏的PPV快速檢測(cè)RT-PCR反應(yīng)體系。建立PPV的快速檢測(cè)技術(shù)體系，可對(duì)已收集與保存的杏、李資源進(jìn)行PPV抗性評(píng)價(jià)，也可對(duì)從歐美PPV高發(fā)地區(qū)引進(jìn)的櫻桃和桃等核果類果樹資源進(jìn)行擴(kuò)展檢測(cè)，為控制PPV病毒在我國(guó)的發(fā)生與傳播提供一定的技術(shù)支撐。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合BSA法是篩選與目的基因緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記的一個(gè)有效方法。在果樹和作物上，通過此方案已經(jīng)對(duì)許多控制重要農(nóng)藝性狀的基因進(jìn)行了標(biāo)記的篩選[21-23]。本研究利用此方法，對(duì)已經(jīng)發(fā)表的PPV抗性基因定位區(qū)間內(nèi)的多個(gè)SSR標(biāo)記在PPV抗性分離群體中進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記PGS1.23與抗PPV基因連鎖程度最高，檢測(cè)分離群體PPV抗性的符合度達(dá)到了78.3%。而Decroocq等[8]用PGS1.23在多個(gè)歐洲品種材料上都沒有擴(kuò)增產(chǎn)物，這可能與試驗(yàn)材料和條件有關(guān)。獲得與抗PPV基因緊密連鎖分子標(biāo)記PGS1.23，一方面，可用于抗PPV育種的早期輔助選擇，在苗期進(jìn)行抗病株系的篩選，可有效節(jié)約人力、土地資源，并加快抗病育種進(jìn)程；另一方面，可用來在我國(guó)本土杏、李資源中尋找抗PPV的重要材料。目前，我國(guó)杏、李主產(chǎn)區(qū)尚未發(fā)生過PPV病毒病的爆發(fā)流行，由此可認(rèn)為我國(guó)本土的資源中也許存在抗病性材料，所以利用建立起來的檢測(cè)技術(shù)和抗PPV連鎖標(biāo)記對(duì)資源圃現(xiàn)有的杏、李資源進(jìn)行PPV抗性評(píng)價(jià)，初步篩選出了5份抗PPV的杏品種資源，可為抗PPV育種提供較好的親本材料，也為進(jìn)一步對(duì)抗PPV基因的挖掘研究奠定了基礎(chǔ)。