河南省豬流行性腹瀉病毒S和ORF3基因的克隆與序列分析

趙 麗，韓昊瑩，張鴻鑫，盧婷婷，王文靜，陳紅英

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450011；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.鄭州市豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病。在臨床上可導(dǎo)致各種年齡的豬發(fā)生嘔吐、水樣腹瀉、脫水等癥狀，其中，新生仔豬的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%[1]。該病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，尤其以歐洲和亞洲最為嚴(yán)重[2-3]。由于PEDV疫苗在我國的使用，該病得到有效控制，但2010年10月以來，PED在河南省呈現(xiàn)暴發(fā)流行，仔豬病死率高達(dá)100%，而且免疫豬場也沒能幸免，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

PEDV為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組全長28 kb，編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白包括纖突(S)蛋白、小膜(E)蛋白、膜(M)蛋白和核衣殼(N)蛋白[6]。研究發(fā)現(xiàn)，S蛋白在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生、特異性受體的結(jié)合以及細(xì)胞膜融合方面發(fā)揮重要的生物學(xué)作用[7-8]，同時(shí)，S蛋白的變異會(huì)引起PEDV宿主范圍、組織細(xì)胞培養(yǎng)及其毒力發(fā)生改變[9]。由于S基因在遺傳進(jìn)化分析上存在較高的變異性，不同分離株S基因之間存在不同程度的核苷酸插入、突變和刪減等現(xiàn)象，因此，其常被用來研究不同時(shí)間和不同地區(qū)流行毒株的親緣關(guān)系[10-11]。ORF3基因位于E蛋白與S蛋白之間，長675 bp，編碼224個(gè)氨基酸多肽，分子量為25.3 ku。該基因的缺失不影響病毒的增殖與復(fù)制，但會(huì)導(dǎo)致病毒在宿主體內(nèi)的毒力弱化[12]。

本研究于2015年1-12月對來自河南省不同豬場的150份臨床病料進(jìn)行了RT-PCR檢測，對PEDV的S基因和ORF3基因進(jìn)行克隆和測序并進(jìn)行序列分析，旨在為該病的分子流行病學(xué)研究和制定有效的防控措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源 2015年1-12月收集的來自河南省規(guī)模化豬場疑似豬流行性腹瀉的病豬小腸和糞便，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、RNA抽提試劑TRIzol、dNTPs、DNA Marker DL2000、DNA凝膠回收純化試劑盒等，均購自北京康為生物工程有限公司。pMD18-T載體、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、Pst Ⅰ等，均購自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計(jì) 依據(jù)GenBank已公布的PEDV CV777株全基因組序列(登錄號(hào)AF353511)中S和ORF3基因，利用引物設(shè)計(jì)軟件Obligo 7.0和Primer 6.0，設(shè)計(jì)3對特異性引物(表1)用于擴(kuò)增PEDVS1、S2和ORF3基因全序列，擴(kuò)增片段長度分別為2 300，2 100，850 bp，引物由北京三博生物工程公司合成。

表1 PEDV擴(kuò)增引物Tab.1 The specific amplification primes for S1， S2 and ORF3of PEDV

1.2.2 樣本處理及RNA的提取 取少量小腸腸道及其內(nèi)容物或糞便，使用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)進(jìn)行5倍稀釋后研磨，反復(fù)凍融2～3次，8 000 r/min離心10 min，取上清。按照TRIzol Reagent試劑盒使用說明書進(jìn)行總RNA提取，置于-20 ℃保存。

1.2.3 RT-PCR檢測PEDV 提取的總RNA按照Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR擴(kuò)增后1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4S和ORF3基因的克隆及測序 以RT-PCR檢測為陽性樣品的cDNA為模板，進(jìn)行S和ORF3基因的擴(kuò)增。將目的基因連接至pMD18-T載體。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，陽性克隆送至上海生物工程股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DNAStar軟件對15株P(guān)EDV河南地區(qū)流行毒株及參考毒株的S和ORF3基因進(jìn)行核苷酸序列和氨基酸序列分析；利用MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床病料檢測結(jié)果

2015年1-12月共檢測河南省不同規(guī)模豬場的150份臨床病料，結(jié)果顯示，有108份病料能擴(kuò)增出與目的基因一致的特異性條帶，總體檢出率為72%，說明PEDV為引起河南省仔豬腹瀉的主要病原之一。其中對不同月份的 PEDV檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，2015年的2-4月的臨床病料PEDV檢出率最高，每年的7-8月PEDV檢出率最低。

2.2 PEDV S和ORF3目的基因RT-PCR擴(kuò)增

利用3對引物分別對15株具有代表性的PEDV的S和ORF3基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，與預(yù)期目的條帶一致(圖1)。

DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL2000；1.PEDV S1基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2.PEDV S2基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3.PEDV ORF3基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.陰性對照。M.DNA Marker DL2000；1.RT-PCR product of PEDV S1；2.RT-PCR product of PEDV S2；3.RT-PCR product of PEDV ORF3 gene；4.Negative control.

2.3 基因序列測序結(jié)果

對15株河南流行毒株的S和ORF3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和序列測定可知，通過NCBI Blast分析與已公布的PEDVS和ORF3基因序列同源性均高達(dá)95%以上，表明成功克隆了15株P(guān)EDV河南株S和ORF3基因序列，同時(shí)將所測序列提交GenBank，序列號(hào)見表2。

表2 PEDV基因序列分析樣品與參考毒株信息Tab.2 Analysis of PEDV gene sequence samples and reference plant information

2.4 基因同源性分析

運(yùn)用DNAStar軟件中的Clustal W method對15個(gè)毒株的S基因序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明，各毒株之間的核苷酸同源性為97.7%～99.5%，氨基酸同源性為97.0%～99.1%。與GenBank中登錄的代表性參考株相比，核苷酸同源性為93.2%～99.0%，氨基酸同源性為92.3%～98.8%。與經(jīng)典株CV777相比，核苷酸同源性為93.6%～93.9%，氨基酸同源性為92.2%～93.1%。而且各毒株除了多處點(diǎn)突變之外，還存在堿基的插入和缺失現(xiàn)象，各毒株與CV777相比，在163 ～165 bp處存在3個(gè)堿基插入，在177～185 bp處有9個(gè)堿基的插入，在206 bp處有1個(gè)堿基插入，在416～418 bp處有3個(gè)堿基插入；同時(shí)，在218 bp處缺失1個(gè)堿基，在480～482 bp處缺失3個(gè)堿基。

本研究所擴(kuò)增的ORF3基因均含675個(gè)堿基，編碼224個(gè)氨基酸殘基。對15株P(guān)EDVORF3基因比對可知，各毒株之間的核苷酸同源性為97.2%～100%，氨基酸同源性為95.1%～100%。與GenBank中登錄的代表性參考株相比，核苷酸同源性為95.0%～100%，氨基酸同源性為93.7%～100%。與經(jīng)典株CV777相比，核苷酸同源性為97.7%～100%，氨基酸同源性為93.7%～100%。本研究毒株與疫苗毒株CV777相比，河南株在氨基酸82-98位點(diǎn)上不存在17個(gè)氨基酸的缺失；與疫苗株attenuated DR13相比，在82-99氨基酸位點(diǎn)上不存在18個(gè)氨基酸的連續(xù)缺失現(xiàn)象。

2.5 基因序列進(jìn)化樹分析

用MEGA6軟件，將本試驗(yàn)中擴(kuò)增得到的15株S基因核苷酸序列，與GenBank 中已發(fā)布的10株P(guān)EDV參考毒株序列一同構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，可將PEDVS基因分為兩大群(圖2)。其中本試驗(yàn)擴(kuò)增的15株則獨(dú)立成群，構(gòu)成G2群(標(biāo)記▲)，與其他參考毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。對于ORF3基因，可將PEDVORF3基因分為2個(gè)群(圖3)。其中Ⅰ群包括CV777株和attenuated DR13；除Ⅰ群之外，其他所有毒株可歸為Ⅱ群，其中，本研究的15個(gè)PEDV毒株(標(biāo)記▲)與國內(nèi)分離株(CH-S、AJ1102、CH-ZMDZY-2011、GD-1、LZC)、美國株(USA-Colorado-2013、USA-Iowa-18984-2013)及韓國株DR13均有較近的親緣關(guān)系；同時(shí)，對于S和ORF3基因在整個(gè)進(jìn)化關(guān)系中，本試驗(yàn)中的15個(gè)河南株均相對獨(dú)立成群，與經(jīng)典毒株CV777及國內(nèi)所使用的疫苗株，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

▲.河南株；○.國內(nèi)分離株。圖3同?！?Isolates from Henan；○.Domestic isolates.The same as Fig.3.

圖3 PEDV ORF 3基因核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic analysis according to the sequences of PEDV 3 genes

3 結(jié)論與討論

2010年10月份開始，PED在我國大面積暴發(fā)流行，導(dǎo)致上百萬頭仔豬死亡[13]，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究通過對2015年1-12月采集的35家豬場150份的疑似流行性腹瀉的糞便及腸內(nèi)容物進(jìn)行RT-PCR檢測，得到陽性率為72%(108/150)，而這些豬場幾乎都免疫了PEDV基于CV777毒株的疫苗，表明河南省2015年豬場PEDV具有普遍流行的特點(diǎn)，疫苗已經(jīng)不能為現(xiàn)有的流行毒株提供有效的抗體保護(hù)。

PEDV毒株是單一血清型，但是發(fā)病豬場使用了CV777疫苗免疫后，仔豬的發(fā)病率和死亡率依舊高發(fā)，說明流行毒株極有可能發(fā)生了變異或者毒力增強(qiáng)導(dǎo)致疫苗株的免疫保護(hù)效果不足以保護(hù)豬群免于感染發(fā)病[14]。通過對采集病料的S基因和ORF3基因的遺傳演化關(guān)系表明，2015年河南省臨床檢測到的PEDVS基因有了較大的變異，與經(jīng)典毒株CV777相比較，除了點(diǎn)突變外，在163 ～165 bp處存在3個(gè)堿基插入，在177～185 bp處有9個(gè)堿基的插入，在206 bp處有1個(gè)堿基插入，在416～418 bp處插入3個(gè)堿基；同時(shí)，在218 bp處缺失1個(gè)堿基，在480～482 bp處缺失3個(gè)堿基。2015年河南省臨床檢測到的 PEDV株與CV777核苷酸同源性為93.6%～93.9%，氨基酸同源性為92.2%～93.1%，這與陳建飛等[15]發(fā)現(xiàn)的不同地區(qū)的病毒毒株結(jié)果有明顯的差異；王飛等[16]、劉文俊等[17]、霍金輝等[18]發(fā)現(xiàn)PEDV的S和ORF3基因發(fā)生變異的結(jié)果相符合。

河南省15株P(guān)EDVS基因測序毒株與國內(nèi)外毒株序列S基因遺傳演化關(guān)系表明，對于S和ORF3基因在整個(gè)進(jìn)化關(guān)系中，本試驗(yàn)中的具有代表性的15個(gè)河南株均相對獨(dú)立成群，與經(jīng)典毒株CV777及國內(nèi)所使用的疫苗株，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。這與喬涵等[19]對河南地區(qū)豬流行性腹瀉病毒所做的PEDVS基因序列分析的結(jié)果一致。沈永恕等[20]通過對河南省2011年豬流行性腹瀉M基因遺傳進(jìn)化分析，說明2011年河南省流行的豬流行性腹瀉是一個(gè)新的基因型。正是由于現(xiàn)在流行的毒株與現(xiàn)有的疫苗株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，使用的疫苗不能完全保護(hù)豬群免受病毒的侵害，這可能是導(dǎo)致豬流行性腹瀉在免疫豬群中流行的原因。