基于均勻和正交試驗設(shè)計的膠束電動毛細(xì)管色譜法同時測定消毒劑和抗抑菌產(chǎn)品中3種核苷類抗病毒藥物

王 萍, 李夢琦, 趙麗媛, 楊 屹, 丁曉靜*

(1. 北京市疾病預(yù)防控制中心, 北京 100013; 2. 北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心, 北京 100013; 3. 北京化工大學(xué)理學(xué)院, 北京 100029)

近50%抗病毒藥物均為核苷類藥物,如更昔洛韋、阿昔洛韋和噴昔洛韋等。這類藥物在臨床上是治療艾滋病、皰疹、肝炎等病毒性疾病的首選,1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))噴昔洛韋和3%～5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))阿昔洛韋還因?qū)畎捳詈蜕嘲捳钣幸欢ǖ闹委熜ЧＳ糜谄つw科外用藥膏中[1]。這些藥物多數(shù)對宿主細(xì)胞有一定的毒性,口服難以吸收,多為外用[2]。因此原衛(wèi)生部發(fā)布的《消毒產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生規(guī)范》(2009年版)以及《消毒產(chǎn)品衛(wèi)生安全評價》均禁止在消毒產(chǎn)品中添加此類藥物,并在全國開展整治消毒產(chǎn)品違法宣傳療效和添加藥物的專項行動,但由于目前沒有相應(yīng)配套的消毒劑和抗抑菌產(chǎn)品中更昔洛韋、阿昔洛韋和噴昔洛韋這3種最為常見的外用核苷類抗病毒藥物的檢測方法,因而無法實現(xiàn)對消毒劑和抗抑菌產(chǎn)品的有效監(jiān)管。因此,迫切需要建立同時分析這3種抗病毒藥物的方法,以維護(hù)消費者的健康和經(jīng)濟(jì)利益。

目前抗病毒藥物的分析方法主要有紫外分光光度法[3]、高效液相色譜(HPLC)法[3-7]、毛細(xì)管電泳(CE)法[8-12]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[13-16]。其中,HPLC和LC-MS主要用于藥品和血漿等的分析。LC-MS所用儀器昂貴,測定成本較高,而HPLC需消耗大量的有機(jī)溶劑。CE則具有分離效率高、無需有機(jī)溶劑和運行成本低等優(yōu)點,在水溶性差的抗病毒藥物分析中有一定優(yōu)勢。Saleh等[8]以60 mmol/L硼砂+40 mmol/L SDS為分離緩沖液(pH 9.25),對人體血漿中的更昔洛韋進(jìn)行了測定,但在這個條件下阿昔洛韋和更昔洛韋兩峰重疊,不能分開,不能實現(xiàn)阿昔洛韋與更昔洛韋的同時測定。Yeh等[9]用30 mmol/L Tris+140 mmol/L SDS(pH 8.0)作為分離緩沖溶液,不需要進(jìn)行樣品前處理,直接進(jìn)樣就能對生物樣本(血漿和腦脊液)中的阿昔洛韋進(jìn)行測定。Vo等[10]以90 mmol/L硼酸+175 mmol/L SDS+100 mmol/L羥丙基-β-環(huán)糊精+0.2%(質(zhì)量體積分?jǐn)?shù))NaCl(pH 8.8)為分離緩沖溶液,以大體積進(jìn)樣(進(jìn)樣時間100 s),進(jìn)行了血漿中阿昔洛韋的高靈敏檢測。梁改玲等[11]以30 mmol/L硼砂(pH 9.6)為分離緩沖液,實現(xiàn)了復(fù)方阿昔洛韋滴眼液中阿昔洛韋含量的測定。Neubert等[12]采用20 mmol硼砂+10 mmol/L SDS+5 mmol/L十二烷基三甲基溴化銨溶液作為分離緩沖溶液,著重研究了如何從親水或者親脂的藥品配方中將阿昔洛韋和溴夫定分離開并能快速檢出這兩種藥物的方法。但是,文獻(xiàn)所報道的CE方法主要是分析藥品和生物樣品中3種常用外用抗病毒藥物中的某一種,也沒有在消毒劑和抗抑菌產(chǎn)品中的分析方法,因此有必要建立消毒劑和抗抑菌產(chǎn)品中3種常用外用抗病毒藥物的CE分析方法。

鑒于影響CE分離分析的因素多,各因素之間的交互作用較強(qiáng),采用通常的單因子優(yōu)化方法所獲得的最佳分離條件實際上可能并不是最佳的條件。為找到最佳的分析條件,往往要做很多試驗。因此,運用統(tǒng)計學(xué)方法探尋各種影響因素之間的相互關(guān)系并盡可能以最少試驗次數(shù)得到最佳分離條件的方法已應(yīng)用于CE最佳分離條件的優(yōu)化[17-20]。黃志東[17]和吳惠芳等[18]使用均勻試驗設(shè)計,付小帥等[19]和郭雯雯等[20]使用正交試驗設(shè)計對影響CE分離的多種影響因素進(jìn)行了考察,并最終確定了最佳分離條件。本研究結(jié)合均勻設(shè)計及正交設(shè)計各自的特點,分別使用3因素7水平的均勻設(shè)計及4因素4水平的正交設(shè)計,較為全面、系統(tǒng)和科學(xué)地對分離條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了同時分析3種抗病毒藥物的膠束電動毛細(xì)管色譜(MEKC)新方法,并對噴劑、洗劑、膏狀和乳狀等不同劑型的復(fù)方化學(xué)消毒劑或抗抑菌產(chǎn)品進(jìn)行測定,同時對乳膏型及凝膠型藥品也進(jìn)行了測定,獲得了滿意結(jié)果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ型毛細(xì)管電泳儀配備二極管陣列檢測器(美國Beckman公司); Millipore Milli-Elix/RiOs型超純水器(美國Millipore公司);渦旋振蕩器(英國Bibby Sterilin有限公司); F-50A酸度計(北京屹源電子儀器科技公司); Universal 32型高速離心機(jī)(德國Hettich公司);未涂層熔融石英毛細(xì)管柱(河北永年瑞灃色譜器件有限公司)。

氫氧化鈉(NaOH,分析純,北京化學(xué)試劑公司);無水磷酸二氫鈉(NaH2PO4,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);SDS(分析純,美國Sigma公司);十水合四硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O,分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品:更昔洛韋(純度>97%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);阿昔洛韋(純度>99.8%,中國食品藥品檢定研究院);噴昔洛韋(純度>98.0%,日本東京化成工業(yè)株式會社)。

樣品:在淘寶網(wǎng)購買了帶有“衛(wèi)消證字”,包裝或說明書中標(biāo)識有抑菌、除癬、止癢、保持菌群平衡等作用的噴劑、洗劑、膏狀和乳狀等不同劑型的復(fù)方化學(xué)消毒劑共6件。還從北京當(dāng)?shù)厮幏抠徺I了1件更昔洛韋眼用凝膠(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%)、1件阿昔洛韋凝膠(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)及1件噴昔洛韋乳膏(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)。

1.2 分離緩沖溶液及樣品提取液

分離緩沖溶液為10 mmol/L硼砂+25 mmol/L磷酸二氫鈉(pH 7.41)+140 mmol/L SDS。樣品提取液為用超純水稀釋10倍的分離緩沖溶液。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取10 mg(精確到0.000 1 g)更昔洛韋、阿西洛韋、噴昔洛韋,分別用樣品提取液定容至10 mL,配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取適當(dāng)體積的上述儲備液,用樣品提取液稀釋成質(zhì)量濃度分別為2、20和40 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

稱取1.0 g樣品,置于10 mL具塞離心管(比色管)中,加樣品提取液至10 mL,渦旋1 min混勻。如果是液體樣品,可直接進(jìn)樣,如果是乳膏樣品,還應(yīng)再超聲提取10 min,離心后取上清液進(jìn)樣。

1.5 電泳條件

未涂層熔融石英毛細(xì)管(30.2 cm×50 μm,有效長度為20 cm)。分離電壓為10 kV;進(jìn)樣時間為4 s;檢測波長為250 nm;操作溫度為25 ℃。

新裝毛細(xì)管在使用前分別用1 mol/L NaOH沖洗20 min,超純水沖洗5 min,分離緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用1 mol/L NaOH沖洗1.5 min,超純水沖洗1.5 min,分離緩沖液沖洗1.5 min,以保證遷移時間和校正峰面積的重現(xiàn)性。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

使用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

梁改玲等[11]用CE測定復(fù)方阿昔洛韋滴眼液中阿昔洛韋的含量時,選擇240 nm為檢測波長。本研究對更昔洛韋、阿西洛韋和噴昔洛韋在CE分離緩沖溶液中的紫外吸收光譜進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)最大吸收波長均在250 nm左右,因此選擇250 nm為檢測波長。

2.2 分離緩沖體系的優(yōu)化

2.2.1分離緩沖體系的選擇

在大城市想找份工作立穩(wěn)腳跟是很難的，想不到在小城市生存競爭也這么激烈。一個薪水低得不能再低的職位，竟然有十多名大學(xué)生去搶，更不要說稍微像樣的工作了。我從一家招聘英語教師的輔導(dǎo)培訓(xùn)學(xué)校摔門而出，因為他們一個月僅開1200塊錢工資加一點菲薄的課時費，這么低的待遇還要任課老師雙休日去公共場所拉生源。我想象自己站在少年文化宮門前像出臺的婊子拉客那樣，腆著臉拉小學(xué)生們來參加培訓(xùn)，簡直無法忍受。薪水再低我都忍了，準(zhǔn)備先干著再說，唯有這拉生源的條件成為壓垮駱駝的最后一根稻草，讓我摔門而去。

由于阿昔洛韋的pKa1=2.52, pKa2=9.35,參照Saleh等[8]的報道采用硼砂-SDS作為分離緩沖體系。Saleh等[8]調(diào)節(jié)pH使用的是NaOH和HCl,而為了得到較寬pH緩沖范圍,本文選用磷酸二氫鈉來調(diào)節(jié)pH,這樣做可以保證使用均勻試驗設(shè)計和正交試驗設(shè)計時,萬一pH無法落在硼砂緩沖體系的范圍內(nèi),還可落在磷酸鹽的緩沖范圍內(nèi),因硼砂和磷酸緩沖體系的緩沖范圍分別為pH 8.24～10.24和pH 6.20～8.20,在這兩個pH范圍內(nèi),緩沖液均有較強(qiáng)的緩沖能力,可獲得良好的遷移時間重現(xiàn)性。另外,在緩沖體系中加入SDS,除了可以增加分離度外,還可以增加高pH條件下各抗病毒藥物的溶解性[12]。

2.2.2分離緩沖體系中各影響因素濃度的優(yōu)化

有文獻(xiàn)[17,18]用均勻試驗設(shè)計及逐步回歸的統(tǒng)計方法找到了影響CE分離主要因素之間的關(guān)系。受此啟發(fā),本文選取較長的管長(70 cm×50 μm)、適宜的電壓(26 kV)及進(jìn)樣時間(15 s)進(jìn)行均勻試驗設(shè)計。參考使用硼砂體系分離抗病毒藥物的文獻(xiàn)[8,11,12]以及以往試驗的經(jīng)驗,在較大范圍內(nèi)選定7個濃度水平的SDS、磷酸二氫鈉和硼砂,按74均勻設(shè)計表進(jìn)行試驗(見表1),以期找到分離體系中SDS、磷酸二氫鈉和硼砂與分離度之間的關(guān)系。試驗結(jié)果見表1。

表 1 均勻試驗設(shè)計因素與水平及分離度結(jié)果

Resolution 1 is the resolution between the first peak and the second peak. Resolution 2 is the resolution between the second peak and the third peak.

由表1可見,使用高濃度SDS時,各峰間的分離度要明顯好于使用低濃度時的分離度。但磷酸二氫鈉和硼砂的濃度對分離度的影響很難從表1中得出結(jié)論。將平均分離度作為因變量,將SDS濃度、磷酸二氫鈉濃度、硼砂濃度以及它們之間的交互作用(即SDS與磷酸二氫鈉濃度乘積、磷酸二氫鈉與硼砂濃度乘積和SDS與硼砂濃度乘積)作為自變量,用SPSS 19.0軟件進(jìn)行線性逐步回歸分析。其主要判據(jù)是:方程的F值(總回歸方程線性假設(shè)檢驗值)大于F(0.05)(顯著水平為0.05時的F值),且方程各項系數(shù)的t(每個自變量偏回歸系數(shù)假設(shè)檢驗值)值大于t(0.05)(顯著水平為0.05時的t值)[17,18]。滿足這兩個條件的逐步回歸分析得到A=8.192-0.004B,A為平均分離度,B為磷酸二氫鈉和硼砂的濃度乘積。方程的F值為41.090,P值為0.001;常數(shù)和磷酸二氫鈉與硼砂濃度乘積的t值分別為14.23和6.41,P值為分別為0.000 03和0.001;相關(guān)系數(shù)r為0.944。結(jié)果表明,在選定的范圍內(nèi),磷酸二氫鈉和硼砂的乘積與平均分離度呈線性關(guān)系,且此乘積越小,平均分離度越大。要想得到滿意的分離度,SDS應(yīng)取最大濃度,且磷酸二氫鈉和硼砂應(yīng)盡量取其乘積最小的濃度。

正交試驗設(shè)計是處理多因素試驗的一種科學(xué)的試驗方法,它利用“正交表”,合理安排試驗,若再對正交試驗結(jié)果進(jìn)行簡單的統(tǒng)計分析,則可得到目標(biāo)最優(yōu)值的實驗條件[19,20]。依據(jù)上述試驗結(jié)果,將SDS的濃度加大,分別取80(水平1)、100(水平2)、120(水平3)和140 (水平4)mmol/L共4個濃度水平;減小磷酸二氫鈉和硼砂的濃度,但是因為需要考慮溶液的緩沖能力,因此分別選取10(水平1)、15(水平2)、20(水平3)和25(水平4)mmol/L這4個濃度。參照文獻(xiàn)[21],用SPSS 19.0進(jìn)行4因素(SDS、磷酸二氫鈉、硼砂及空白列)4水平正交試驗設(shè)計并進(jìn)行方差分析以,便最終確定SDS、磷酸二氫鈉和硼砂的濃度。正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3,極差分析結(jié)果見表4。

從表3可知,SDS、磷酸二氫鈉和硼砂的Sig.(顯著性差異)均小于0.05,表明3個因素對平均分離度均有影響;3個因素的F值大小的次序依次為SDS>磷酸二氫鈉>硼砂,也就意味著影響平均分離度的大小次序為SDS>磷酸二氫鈉>硼砂。

正交試驗設(shè)計的極差分析表中,極差最大的即為對分離度影響最大的因素,在4個試驗水平中均值最大的即為最佳實驗條件。從表4可見,極差最大的是SDS,然后依次為磷酸二氫鈉和硼砂。極差分析表與方差分析表得出相同的結(jié)論,即對分離度影響最大的是SDS,最小的是硼砂。從表4中得出的最佳試驗條件為:SDS取水平4的濃度即140 mmol/L;磷酸二氫鈉取水平4的濃度即25 mmol/L;硼砂取水平1的濃度即10 mmol/L。因為各峰之間的分離度較大,為了節(jié)省時間,將毛細(xì)管縮短至30.2 cm,并降低電壓至10 kV,進(jìn)樣時間縮短至4 s,按照前面選取的最佳緩沖條件,同樣得到了令人滿意的結(jié)果(見圖1a)。

表 2 正交試驗設(shè)計的因素和水平及分離度結(jié)果

圖 1 最佳條件下3種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、藥品樣品及 抑菌樣品的電泳圖Fig. 1 Electropherograms of the three kinds of antiviral drug mixed standard, a pharmaceuticals sample and a bacteriostatic sample under the optimal conditions a. 20 mg/L mixed standard solution (ganciclovir, acyclovir, and penciclovir); b. the bacteriostatic sample; c. ganciclovir ophthalmic gel; d. acyclovir gel; e. penciclovir cream. Peak Nos.: 1. ganciclovir (3.879 min); 2. acyclovir (4.279 min); 3. penciclovir (4.867 min); 4. unknown peak.

SourceType Ⅲsum of squaredfMean squareFSig.Corrected model39.16394.35129.6380.000Intercept926.1371926.1376307.8510.000SDS27.67439.22562.8280.000NaH2PO49.27833.09321.0640.001Na2B4O72.21230.7375.0210.045Error0.88160.147//Total966.18116///

df: degrees of freedom;F: statistic value for analysis of variance; Sig.: significance; /: not calculated.

表 4 正交試驗設(shè)計的極差分析

表 5 3種抗病毒藥物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

y: corrected peak area;x: mass concentration, mg/L.

在選定的最佳條件下,以各抗病毒藥物的質(zhì)量濃度(x, mg/L)為橫坐標(biāo),校正峰面積(y)為縱坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線。檢出限以噪聲的3倍計算。3種抗病毒藥物的校準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢出限(LOD)及取1 g樣品時的定量限(LOQ)見表5。

2.2.4精密度與準(zhǔn)確度

往不含3種抗病毒藥物的液體樣品、膏狀樣品及乳狀樣品中分別加入低(2 mg/L)、中(20 mg/L)和高(40 mg/L)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在最佳電泳條件下進(jìn)行測定。3種物態(tài)樣品加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表6。更昔洛韋的回收率為88.8%～102.7%;阿昔洛韋的回收率為85.4%～101.0%;噴昔洛韋的回收率為85.5%～104.1%; 3種抗病毒藥物的低、中和高濃度加標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均<8%。

表 6 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果(n=6)

2.2.5樣品測定

用上述方法對6件不同劑型的復(fù)方化學(xué)消毒劑與抗抑菌產(chǎn)品樣品進(jìn)行測定,均未檢出抗病毒藥物,其中某抑菌產(chǎn)品的色譜圖見圖1b。同樣用上述方法對購買的更昔洛韋眼用凝膠(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%)、阿昔洛韋凝膠(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)及噴昔洛韋乳膏(標(biāo)識質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)進(jìn)行測定,測得更昔洛韋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.15%(見圖1c)、阿昔洛韋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.10%(見圖1d)以及噴昔洛韋質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.97%(見圖1e)。測定結(jié)果與標(biāo)識一致。

3 結(jié)論

本文用均勻和正交試驗設(shè)計對MEKC法的分離條件進(jìn)行優(yōu)化,最大限度地實現(xiàn)了3種抗病毒藥物在短時間內(nèi)的有效分離,操作簡單,消耗試劑少,成本低,不使用有機(jī)溶劑。而且方法的精密度及準(zhǔn)確度能夠滿足消毒劑與抗抑菌產(chǎn)品中抗病毒藥物的日常分析需要。