堿性藥物在硫醚嵌入苯磺酸硅膠固定相上的色譜行為

王曉歡, 陳磊

(天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 天津 300072)

隨著新藥的不斷開發(fā),藥物分子呈現(xiàn)出更為復(fù)雜多樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì),對復(fù)雜藥物的分離分析提出了更高的要求。高效液相色譜(HPLC)作為一種有效的分離手段在藥物分析方面的應(yīng)用越來越廣泛。反相色譜(RPLC)以其對疏水性化合物較強(qiáng)的選擇性和靈敏度,在藥物分析中應(yīng)用廣泛。但其對強(qiáng)極性和離子型化合物的保留較弱,在分離堿性化合物時常導(dǎo)致峰形拖尾、柱效和重復(fù)性變差[1]。離子交換色譜(IEC)常用于分離可解離或離子型化合物,但對于帶相同電荷而疏水部分有差異的化合物分離度較差[2]。離子對色譜(IPC)克服了以上困難,通過在流動相中加入離子對試劑,增加了離子型化合物在反相色譜中的保留,能夠同時分離中性和離子型化合物[3]。然而由于離子對試劑的引入造成柱平衡時間較長,并且與質(zhì)譜不兼容,不適用于梯度洗脫和制備純化,這些缺陷都限制了IPC在分離分析中的廣泛應(yīng)用。

模仿IPC與離子型化合物的多種作用,混合模式色譜(MMC)依靠表面的多功能基團(tuán),在不使用離子對試劑的情況下,能夠?qū)崿F(xiàn)復(fù)雜樣品的分離[4-6]。反相/離子交換色譜(RP/IEC)因其高度的正交性,是開發(fā)和研究最多的混合模式色譜,在核苷酸及蛋白質(zhì)分離[7,8]、藥物雜質(zhì)檢測[9-11]、代謝研究[12]、天然產(chǎn)物分離純化[13,14]等方面得到了廣泛的應(yīng)用。

近年來,關(guān)于混合模式色譜制備和應(yīng)用的報道很多,但對其保留機(jī)理的系統(tǒng)研究卻很少且存在爭議[15-19]。這是由于RP/IEC鍵合多種功能基團(tuán),溶質(zhì)的保留受反相和離子交換兩種作用的影響[19,20],使得其色譜保留機(jī)理變得更復(fù)雜。最初,研究人員通過考察反相色譜上堿性化合物與疏水鏈和解離硅羥基的作用來探討RP/IEC的混合保留機(jī)理。Yang等[15]研究了堿性化合物在C18和聚丁二烯修飾二氧化鋯(PBD-ZrO2)兩種固定相上的保留機(jī)理,在不同鹽濃度流動相中,觀察一系列對烷基芐胺同系物的色譜行為,認(rèn)為兩個固定相上反相和離子交換兩種位點單獨起作用。Neue等[17]提出了三種作用形式的保留模型,表明除上述兩種單獨作用外,還存在兩個位點的同時作用,稱之為反相協(xié)同的離子交換作用,并且該作用對帶電堿性化合物在C18固定相上的保留具有重要影響。Zhang等[18]探討了幾種堿性化合物在反相/弱陽離子交換色譜(RP/WCX)上的保留行為,采用反相和離子交換兩種作用形式保留模型,考察了流動相中不同類型反離子的影響。綜上所述,對于RP/IEC混合模式色譜的保留機(jī)理,多數(shù)研究者更傾向于兩種位點單獨作用的保留模型,而忽略了協(xié)同作用的影響。

巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)[21,22]具有條件溫和、簡單高效、反應(yīng)可控、產(chǎn)率高等優(yōu)點,在色譜固定相修飾方面具有潛在優(yōu)勢。本文通過巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)鍵合苯磺酸(單配體)或同時鍵合苯基和苯磺酸(雙配體)得到兩種硫醚嵌入型反相/強(qiáng)陽離子交換(RP/SCX)混合模式固定相。在混合模式色譜條件下,分離了4種強(qiáng)堿性藥物,系統(tǒng)考察了其在不同流動相條件下的保留行為。探討了三種作用形式保留模型的合理性,進(jìn)行了定量分析,揭示了反相/離子交換協(xié)同作用的重要影響,為混合模式色譜固定相設(shè)計和分離條件的優(yōu)化提供了重要的理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Vario Micro Cube元素分析儀(德國Elementar公司),安捷倫1100高效液相色譜分析儀,配G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1329A柱溫箱、G1314B紫外檢測器和ChemStation色譜工作站(美國安捷倫公司)。

球形硅膠(粒徑:10 μm,比表面積:292 m2/g,平均孔徑:10 nm,天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心),巰丙基三甲氧基硅烷(MPTMS,純度98%,湖北武大有機(jī)硅新材料股份有限公司),對苯乙烯磺酸鈉(SS,純度99%,上海源葉生物科技有限公司),苯乙烯(St,純度99%,天津市大茂化學(xué)試劑廠),三乙胺(TEA)、甲醇、無水乙醇和乙腈(純度均為99%,天津市康科德科技有限公司),偶氮二異丁腈(AIBN)、正己醇、四氯化碳和正己烷(純度均為99%,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所),硫酸沙丁胺醇、鹽酸普魯卡因胺、鹽酸可樂定、鹽酸普萘洛爾和鹽酸阿米替林標(biāo)準(zhǔn)品(純度均為99%,中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 RP/SCX混合模式固定相的制備

RP/SCX混合模式固定相的制備途徑如圖1所示。以球形多孔硅膠為原料,經(jīng)氣固相硅烷化反應(yīng)得到巰丙基修飾的硅膠中間相;再經(jīng)巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)鍵合上疏水鏈和磺酸基,得到RP/SCX固定相。典型步驟如下:稱取4 g酸化后的硅膠微球于聚四氟乙烯反應(yīng)釜中,加入1.8 mL(9.6 mmol)MPTMS和1 mL(7.2 mmol)TEA,于150 ℃馬弗爐中反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗滌,于80 ℃真空干燥過夜,得到巰丙基硅膠微球(MPS)。將4 g MPS微球和80 mL甲醇分散于150 mL反應(yīng)瓶中,然后加入0.04 g(0.24 mmol)AIBN, 0.165 g(0.8 mmol)SS和184 μL(1.6 mmol)St,振蕩溶解,通氮氣除氧后密封,放于70 ℃恒溫水浴搖床中震搖12 h,過濾,依次用甲醇、甲醇-水(1∶1, v/v)、甲醇洗滌,80 ℃真空干燥過夜,得到苯基和苯磺酸修飾的雙配體混合模式固定相(Ph/BS)。和上述合成途徑相同,用SS代替SS和St的混合物,得到苯磺酸修飾的單配體混合模式固定相(BS)。

圖 1 Ph/BS固定相合成路線圖Fig. 1 Synthesis route of phenyl/benzenesulfonate (Ph/BS) stationary phaseTEA: triethylamine; AIBN: azobisisobutyronitrile; MeOH: methanol; MPS: mercaptopropyl silica.

1.3 色譜柱的裝填

采用高壓勻漿法裝柱。稱取適量微球樣品,超聲均勻分散于正己醇-四氯化碳混合溶液(1∶1, v/v)中,在30 MPa的壓力下,以正己烷為頂替液,將固定相填充到150 mm×4.6 mm不銹鋼柱管中。

1.4 色譜條件

流動相:乙腈-50 mmol/L KH2PO4(50∶50, v/v, pH 3.0),檢測波長:220 nm,流速:1.5 mL/min,柱溫:30 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 RP/SCX混合模式固定相的表征

圖2為MPS和Ph/BS填料的紅外譜圖?？梢钥闯?與MPS相比,Ph/BS顯示出較強(qiáng)的苯環(huán)特征吸收峰。其中,700和580 cm-1處分別為苯環(huán)碳?xì)涞拿嫱鈴澢駝臃搴捅江h(huán)骨架的伸縮振動峰。1 082 cm-1處為硅氧鍵的伸縮振動峰,在1 500 cm-1附近Ph/BS較MPS明顯變寬,這是由于與磺酸基相連的苯環(huán)的伸縮振動引起的。2 939 cm-1處為苯環(huán)上的碳?xì)渖炜s振動峰,與巰丙基側(cè)鏈上亞甲基的碳?xì)渖炜s振動峰重疊,使得峰強(qiáng)增加。綜上表明,苯基和苯磺酸基團(tuán)已成功鍵合在Ph/BS固定相表面。

圖 2 巰丙基硅膠微球(MPS)和Ph/BS填料的紅外譜圖Fig. 2 IR spectra of MPS and Ph/BS packings

采用元素分析儀對混合模式色譜填料進(jìn)行定量表征,結(jié)果如表1所示。根據(jù)文獻(xiàn)公式[23],巰丙基和苯基的表面覆蓋率(αMP和αPh)通過碳含量計算,苯磺酸的表面覆蓋率(αBS)通過硫含量計算。結(jié)果表明,通過氣固相反應(yīng)得到了較高的巰丙基鍵合量,Ph/BS和BS固定相表面的苯磺酸鍵合量基本相同,且Ph/BS固定相上成功鍵合了苯基基團(tuán)。由于兩種混合模式固定相都是在同一批巰丙基硅膠上鍵合的,所以它們色譜行為的差異可以歸結(jié)為修飾的功能配體不同。

表 1 巰丙基硅膠微球和混合模式固定相的元素分析

αMP: surface coverage of mercaptopropyl groups;αPh: surface coverage of phenyl groups;αBS: surface coverage of benzenesulfonic acid.

2.2 分離堿性藥物

在藥物分析中,堿性藥物的色譜分離一直是被關(guān)注的熱點。由于堿性基團(tuán)的解離,堿性藥物在反相色譜和離子交換色譜分離過程中拖尾嚴(yán)重,這與硅膠表面殘余硅醇基導(dǎo)致的“二級解離平衡”有關(guān)[1]。為避免這種效應(yīng),常需要選擇酸性條件,抑制硅醇基解離(pKa為5～7)。因此,本文制備了兩種以苯磺酸(pKa=-2.8)[24]為離子交換基質(zhì)的RP/SCX混合模式固定相,以期在低pH條件下使堿性化合物獲得較好的峰形并提高分離的選擇性。選擇沙丁胺醇(pKa=9.4, logP=1.69, logP為油水分配系數(shù))、普魯卡因胺(pKa=9.2, logP=3.00)、可樂定(pKa=8.05, logP=3.11)和普萘洛爾(pKa=9.42, logP=3.77)4種結(jié)構(gòu)差異較大的強(qiáng)堿性藥物作為探針,對其在不同流動相條件下的保留行為進(jìn)行了研究。

考察了溫度對溶質(zhì)的色譜保留行為的影響,發(fā)現(xiàn)從20 ℃增加到60 ℃,溶質(zhì)的保留時間明顯縮短。但溫度較低時,由于溶質(zhì)傳質(zhì)變慢,峰形展寬,使得柱效較低;溫度較高時,幾種溶質(zhì)的分離度變差,尤其是在BS固定相上堿性藥物會發(fā)生嚴(yán)重的重疊現(xiàn)象,而且高溫會降低色譜柱的穩(wěn)定性和縮短其使用壽命。因此,綜合柱效、保留和穩(wěn)定性3方面考慮,選取30 ℃進(jìn)行堿性藥物的保留機(jī)理考察。

圖 3 堿性藥物保留因子(kT)對流動相pH作圖Fig. 3 Plots of retention factor (kT) vs. mobile phase pH for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

2.3 pH的影響

流動相pH影響堿性化合物的解離程度,從而改變其在混合模式固定相上的保留。保持流動相中鹽濃度和有機(jī)相比例不變(50 mmol/L KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),改變pH,考察其對堿性藥物保留行為的影響。從圖3a可見,在pH 3～10范圍內(nèi),堿性藥物在BS固定相上均得到較好的保留。由于苯磺酸的pKa為-2.8,在此過程中均處于完全解離狀態(tài)。在pH 3條件下,出峰次序為沙丁胺醇<普魯卡因胺<可樂定<普萘洛爾。除可樂定外,在pH 3～8之間,隨流動相pH的增加,另外3種堿性化合物的保留逐漸增加,在pH=8時保留最強(qiáng)。這是由于硅膠表面的硅醇基解離程度增加,與堿性藥物間發(fā)生了離子相互作用,從而導(dǎo)致保留增加。當(dāng)pH>8時,堿性藥物的保留迅速減弱,是因為高pH條件下堿性物質(zhì)的解離受抑制,與磺酸基間的離子相互作用減小,主要靠反相作用保留?？蓸范ǖ膒Ka比其他3種堿性藥物小,所以在pH>6時即出現(xiàn)解離被抑制的現(xiàn)象。從圖3b可見,在Ph/BS固定相上,堿性藥物的保留隨pH改變呈現(xiàn)相同的趨勢。但與BS固定相相比,在整個pH考察范圍內(nèi),堿性藥物在Ph/BS上的保留更強(qiáng)。在高pH條件下,普魯卡因胺和普萘洛爾在BS固定相上共出峰,而在Ph/BS上卻能得到較好的分離。這說明疏水性苯基的存在對化合物的保留和分離有重要的影響。

2.4 離子強(qiáng)度的影響

依據(jù)離子交換理論,流動相中緩沖鹽影響離子型化合物與固定相間的離子相互作用。對于單純離子交換色譜,單價離子溶質(zhì)的保留與流動相中的反離子濃度呈反比[15]:

(1)

其中,kIEX代表單純離子交換保留因子,[C+]代表流動相中單價反離子濃度(mmol/L),BIEX代表離子交換常數(shù),BIEX與固定相的離子交換容量、溶質(zhì)與固定相間的離子交換平衡常數(shù)及相比有關(guān)。

保持流動相的pH和有機(jī)相比例不變(pH 3.0 KH2PO4-乙腈(50∶50, v/v)),考察了離子強(qiáng)度對堿性藥物保留行為的影響。從圖4可見,在兩個固定相上,隨鹽濃度減小,堿性藥物的保留增強(qiáng),并且保留因子與鹽濃度的倒數(shù)均呈很好的線性關(guān)系,說明在固定相上存在離子交換作用。根據(jù)公式(1),如果只存在單純的離子交換作用,截距應(yīng)為0。從表2可見,兩個固定相的截距都大于0,說明還存在其他作用。

圖 4 堿性藥物kT對流動相中鹽濃度倒數(shù)作圖Fig. 4 Plots of kT vs. inverse buffer concentration for basic drugs a. BS phase; b. Ph/BS phase.

對于RP/IEC混合模式色譜,多數(shù)研究者[15,16]認(rèn)為,溶質(zhì)的總保留因子(kT)受反相作用(保留因子kRP)和離子交換作用(保留因子kIEX)的獨立影響,用公式(2)表示:

(2)

Neue等[17]提出,除這兩種單獨作用外,還存在反相協(xié)同離子交換作用(簡稱協(xié)同作用,kRP/IEX)?；谧杂赡墀B加原理,kRP/IEX可以表示為k*RPk*IEX,因為協(xié)同作用中的反相和離子交換與單純的反相和離子交換不一定相同,故加星號以區(qū)分。因此,總保留因子kT可以表示為以下關(guān)系:

kT=kRP+kIEX+k*RPk*IEX=

(3)

根據(jù)公式(2)和(3),不管協(xié)同作用是否存在,總保留因子與鹽濃度的倒數(shù)都呈正比,并且截距代表反相保留。由表2可知,在兩個固定相上,沙丁胺醇的截距最小，普萘洛爾的截距最大。由于沙丁胺醇和普魯卡因胺logP較小,所以在兩個固定相上的截距差別比較小;而對于疏水性較強(qiáng)的可樂定和普萘洛爾,在Ph/BS固定相上的截距比BS固定相上的截距大,說明疏水性苯基增加了固定相的反相保留。由于兩個固定相的苯磺酸鍵合量基本相同,單純離子交換作用近似一致。然而觀察斜率發(fā)現(xiàn),對于相同溶質(zhì),在Ph/BS固定相上的斜率比BS固定相上的斜率明顯增加,并且反相作用越強(qiáng)的堿性藥物斜率相差越大。這說明斜率與其反相作用有關(guān),因此公式(3)中的三種作用形式的保留模型更適合于RP/SCX混合模式色譜的保留行為研究。

表 2 堿性藥物kT對鹽濃度倒數(shù)作圖的截距、斜率和相關(guān)系數(shù)(r2)

kRP: retention factor based on reversed-phase retention.

根據(jù)公式(3),kT減去kRP可以求得單純離子交換和反相協(xié)同離子交換兩種離子交換作用的總保留值(kIEX+k*RPk*IEX)。從表3可見,在兩個固定相上,隨著鹽濃度增加,堿性藥物的kRP保持不變,總離子交換作用(kIEX+k*RPk*IEX)減小。Ph/BS固定相與BS固定相相比,同一溶質(zhì)在相同條件下,kRP差別不大或增加,但是總離子交換作用增加更為明顯,對于反相作用最強(qiáng)的普萘洛爾,其總離子交換作用增加將近一倍。另外,在兩個固定相上都是總離子交換作用占主導(dǎo),除沙丁胺醇外,其他3種堿性藥物在Ph/BS固定相上的總離子交換貢獻(xiàn)反而比BS固定相強(qiáng)。以上現(xiàn)象說明Ph/BS固定相上增加苯基,一方面提高了固定相的反相保留行為,另一方面明顯增強(qiáng)了協(xié)同效應(yīng),使得總離子交換的保留和貢獻(xiàn)增加。原因可能是:在BS固定相上,當(dāng)堿性藥物同時與苯磺酸自身的反相和離子交換基團(tuán)作用時,才有協(xié)同效應(yīng);而在Ph/BS固定相上,協(xié)同作用還可以發(fā)生在磺酸基和鄰近的苯基之間,這種協(xié)同作用對堿性藥物的保留和選擇性有很大的影響。因此,除了可以改變不同的流動相條件外,還可以通過調(diào)節(jié)雙配體中離子基團(tuán)和疏水基團(tuán)的比例來設(shè)計不同類型的固定相,以滿足不同的分離需求。

表 3 堿性藥物在BS和Ph/BS固定相上各作用保留值及總離子交換貢獻(xiàn)(T)

kIEX: retention factor based on ion-exchange retention;k*RPk*IEX: retention factor based on hydrophobically assisted ion-exchange retention (cooperative retention).

2.5 有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響

維持流動相pH 3和整個體系總離子強(qiáng)度25 mmol/L不變的情況下,僅改變流動相中乙腈的比例(體積分?jǐn)?shù)為35%～50%),考察有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響。從圖5可見,隨流動相中乙腈比例增加,堿性藥物的保留明顯減小,這與大多數(shù)溶質(zhì)在反相色譜中的保留行為一致。

在反相色譜中,對于有機(jī)相和水相的二元混合體系,在一定的有機(jī)溶劑強(qiáng)度范圍內(nèi),反相保留與有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)(φ)的關(guān)系符合線性溶劑強(qiáng)度理論(LSS)[25]:

logkRP=logkW-Sφ

(4)

logkRP代表溶質(zhì)在反相色譜中的保留值;logkW代表溶質(zhì)在純水相條件下的保留,與固定相的疏水性有關(guān);S表示斜率(大小與流動相組成和溶質(zhì)有關(guān))。

從圖5可知,4種堿性藥物的logkT對φACN作圖沒有呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系,而是都表現(xiàn)為向下凹的曲線。在其他有關(guān)混合模式的文獻(xiàn)[26,27]中也觀察到了這種彎曲現(xiàn)象。原因是,在RP/SCX混合模式色譜中,控制流動相中總離子強(qiáng)度不變的情況下,隨有機(jī)溶劑強(qiáng)度的增加,反相作用會減小,而單純離子交換作用基本不變[20]。所以,直接將公式(3)取對數(shù),不能得到logkT與φ的直線關(guān)系。只有當(dāng)單純離子交換作用貢獻(xiàn)很小時,logkT與φ作圖才有較好的線性關(guān)系。由于兩個固定相的離子交換容量相當(dāng),可以近似根據(jù)圖5的截距比較兩個固定相的疏水性,從表4可知,Ph/BS的截距大于BS,說明鍵合苯基增加了固定相的疏水性,與之前的結(jié)果吻合。

圖 5 堿性藥物保留因子對數(shù)與流動相中乙腈體積分?jǐn)?shù)作圖Fig. 5 Plots of log kT vs. acetonitrile volume percentage in mobile phase for basic drugsa. BS phase; b. Ph/BS phase.

ColumnSolutelog kTSloper2BS salbutamol1.010.990.994 procainamide1.681.620.991 clonidine1.791.770.998 propranolol2.553.050.996Ph/BS salbutamol1.221.210.998 procainamide2.032.110.992 clonidine2.182.140.998 propranolol2.793.180.995

2.6 Ph/BS固定相色譜評價

選用5種堿性化合物對Ph/BS固定相進(jìn)行色譜評價。從圖6和表5可見,5種堿性藥物得到很好的分離,并且峰形對稱,對稱因子(AS)都較小。除普魯卡因胺外,其他堿性化合物的拖尾因子(Tf)都在0.95～1.05范圍內(nèi)。隨保留時間延長,色譜峰相應(yīng)變寬,但并不影響柱效和峰形。而且,柱效遠(yuǎn)高于藥典對這5種藥物提出的理論塔板數(shù)的要求(12 000～14 000 plates/m)。由于實驗所用硅膠微球目標(biāo)粒徑為10 μm,其理論板高(h)在3～4之間,可以滿足商品柱對柱效的要求。

目前許多商品的SCX固定相已經(jīng)用于堿性化合物的分離[28-31],并得到較好的分離效果。雙配體Ph/BS固定相與商品SCX固定相相比具有明顯優(yōu)勢。首先,通過點擊化學(xué)方法引入磺酸基團(tuán),延長了疏水側(cè)鏈,增加了反相保留;其次,從上述機(jī)理討論可知,在保證一定的離子交換容量的前提下,Ph/BS固定相也可以通過調(diào)節(jié)疏水性苯基的鍵合量來調(diào)控反相保留行為,對于疏水性不同的離子型化合物具有更強(qiáng)的選擇性。

另外,硫醚嵌入基團(tuán)對色譜保留性質(zhì)也具有重要的影響[32-34]。首先,接近硅膠表面的極性嵌入基團(tuán)對于硅羥基具有一定的屏蔽作用,從而減小堿性化合物與硅醇基作用引起的拖尾現(xiàn)象;其次,極性嵌入基團(tuán)能夠與流動相中的水分子形成氫鍵,增加固定相表面的極性,從而獲得高水相兼容性的特點;最重要的是,硫-芳環(huán)之間會形成電子供體-受體體系,使得芳香化合物的保留和平面選擇性明顯增加。

圖 6 Ph/BS固定相分離堿性藥物色譜圖Fig. 6 Chromatogram of the separation of the basic drugs on Ph/BS stationary phase

Solutetr/minN/(plate/m)hAsTfRsSalbutamol6.75265203.770.961.027-Procainamide13.08258933.860.811.2009.57Clonidine17.57314933.170.931.0384.73Propranolol23.79293003.410.990.9765.05Amitriptyline43.07325403.070.911.0109.87

tr: retention time;N: theoretical plate number;h: theoretical plate height;As: symmetrical factor;Tf: tailing factor;Rs: resolution; -: none.

3 結(jié)論

制備了兩種RP/SCX混合模式固定相,5種堿性藥物均獲得了較好的分離,并且峰形對稱。系統(tǒng)考察了流動相pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑強(qiáng)度的影響,表明存在反相、單純離子交換和反相協(xié)同離子交換3種作用,證明了三種作用形式的保留模型更適合混合模式固定相的機(jī)理研究。定量分析結(jié)果表明,在兩種固定相上單純離子交換和反相協(xié)同離子交換構(gòu)成的總離子交換作用占主導(dǎo),并且反相協(xié)同離子交換作用對溶質(zhì)的保留和分離選擇性影響很大,雙配體固定相上增加疏水性苯基明顯增加了協(xié)同效應(yīng)。與文獻(xiàn)[25]報道不同,單純離子交換存在條件下,混合模式色譜中應(yīng)用LSS公式,不能得到良好的線性關(guān)系。綜上所述,依據(jù)三種作用形式的混合保留機(jī)理,不僅可以從流動相角度,通過改變流動相組成調(diào)節(jié)各作用的占比來優(yōu)化色譜分離;還可以從固定相度角度,通過靈活改變各類型配體的比例來滿足不同的分離要求。本研究對于新型色譜固定相設(shè)計及復(fù)雜樣品的分離優(yōu)化具有重要理論指導(dǎo)意義。