嗜酸乳桿菌LA-G80腸道定植能力研究

蔣德意

(潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700)

乳酸菌是人體正常菌群之一，具有平衡腸道環(huán)境、提高免疫力、抗腫瘤、維持心血管健康等重要生理功能，與人體健康息息相關(guān)[1-3]。嗜酸乳桿菌以較強的耐酸耐膽鹽特性成為乳酸菌家族中極為重視研究和開發(fā)的益生菌，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品和微生態(tài)制劑[4]。乳酸菌的生理功能是否能在人體中體現(xiàn)出來，除了與其能否順利到達腸道有關(guān)外，還與其是否能定植在腸道中有很大關(guān)系。因此本文研究嗜酸乳桿菌LA-G80在腸道中的定植能力，為以后的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

嗜酸乳桿菌LA-G80（L. acidophilus LA-G80），由潤盈生物工程（上海）有限公司菌種保藏中心保存。

1.1.2 實驗動物

實驗SD大鼠由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供，保持溫度（22±2）℃，濕度（56±5）%，每3天換1次鋸末?？刂?2 h光照，12 h黑暗的循環(huán)標(biāo)準(zhǔn)，每天上午7點開燈。實驗大鼠在試驗期間給予自由飲水和自由采食，體重每3天檢測一次。在進行試驗前，均先給予1周的適應(yīng)期，適應(yīng)期內(nèi)飼喂基礎(chǔ)飼料[5-6]。

1.1.3 實驗試劑

細菌基因組DNA小提試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；糞便基因組DNA試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.4 實驗樣品

樣品為在潔凈環(huán)境下生產(chǎn)的嗜酸乳桿菌LA-G80粉末，淺黃色，鋁箔袋包裝。

1.2 方法

1.2.1 灌胃液制備

用生理鹽水稀釋樣品至所需的菌濃度，實驗高劑量組1.0×1010CFU/mL，實驗低劑量組5.0×108CFU/mL，對照組為生理鹽水。

1.2.2 大鼠灌胃

實驗設(shè)3個組，每組15只大鼠，按1 mL/100 g（菌液體積/鼠體重）灌胃，每天早上9點定量灌胃1次，連續(xù)灌胃7天。灌胃期間除定點灌胃外，正常飼喂常規(guī)飼料。于灌胃階段的初始，停止灌胃1天、3天、5天、7天、9天和11天采集大鼠糞便，裝于無菌5 mL EP管中，于-40 ℃保存。

1.2.3 嗜酸乳桿菌LA-G80的特異性引物設(shè)計

提取嗜酸乳桿菌LA-G80的全基因組，采用上海生工生物革蘭氏陽性細菌基因組DNA小提試劑盒抽提。提取后的基因組經(jīng)16S rRNA鑒定[7]是嗜酸乳桿菌LA-G80無誤。

使用引物 p514（5'-TGGATCACCTCCTTTCTA-3'）和 p675（5'-GTGCGCCCTTTATTAACTT-3'）[8-9]對全基因組ISR區(qū)域進行擴增。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min，94 ℃變性 30 s，45 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，30個循環(huán)。將擴增產(chǎn)物用核酸電泳膠驗證，將PCR產(chǎn)物大片段進行膠回收，并將純化回收后的片段序列進行測定。將測定得到的片段序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，選定差異性最大的區(qū)域作為種特異性片段，嗜酸乳桿菌LA-G80種特異性片段長度為500 bp，并根據(jù)菌的同特異性片段設(shè)計種特異性引物。

1.2.4 外標(biāo)準(zhǔn)品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

同時將種特異性片段與pEasy-T1 Simple質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α中。經(jīng)過菌落PCR驗證，提取質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)品，并通過Real-time quantitative PCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 Real-time quantitativePCR測定糞便中菌含量

采用天根生化科技公司糞便基因組DNA試劑盒抽取糞便中的全基因組。將待測糞便樣品DNA抽提液按與制備標(biāo)準(zhǔn)曲線相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行Real-time quantitative PCR反應(yīng)，擴增完畢后，進行溶解曲線分析，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增曲線與靈敏度測定

圖1為不同濃度嗜酸乳桿菌LA-G80作Realtime PCR后顯示的熒光定量擴增曲線。可以看出，不同拷貝數(shù)的模板隨循環(huán)數(shù)的增加，其熒光強度逐漸增強，在經(jīng)過指數(shù)擴增期后曲線趨于平行，即出現(xiàn)平臺效應(yīng)，指數(shù)擴增期模板拷貝數(shù)與熒光累積值的一一對應(yīng)關(guān)系形成了嗜酸乳桿菌LA-G80定量的基礎(chǔ)。從擴增曲線圖可見少至100個菌仍有特征性曲線生長，說明該Real-time PCR具有較好的靈敏度。

圖1 嗜酸乳桿菌LA-G80 l06～102拷貝的模板循數(shù)與熒光強度關(guān)系圖

2.2 嗜酸乳桿菌LA-G80標(biāo)準(zhǔn)曲線

以不同拷貝數(shù)的陽性模板的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反應(yīng)過程中到達熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)（Ct）為縱坐標(biāo)得到嗜酸乳桿菌LA-G80的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，為待測樣品的嗜酸乳桿菌LA-G80定量提供了參照標(biāo)準(zhǔn)。本實驗采集了5個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 嗜酸乳桿菌LA-G80標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 溶解曲線與假陽性

模板在熒光定量PCR反應(yīng)的后期，產(chǎn)物經(jīng)溶解、冷卻后得到溶解曲線如圖3，可見溶解曲線成單峰，說明擴增產(chǎn)物單一，與SYBR GreenⅠ熒光染料結(jié)合的為目標(biāo)DNA片斷，該反應(yīng)條件較好地避免了定量檢測過程中假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

圖3 擴增產(chǎn)物溶解曲線

2.4 大鼠糞便中嗜酸乳桿菌LA-G80定量結(jié)果

各實驗組大鼠糞便內(nèi)嗜酸乳桿菌LA-G80定量結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，灌胃生理鹽水的對照組其檢出的嗜酸乳桿菌LA-G80含量隨時間變化很小，這很好地說明了設(shè)計的種特異性引物的特異性良好，并表明此種檢驗方法的有效性良好。灌胃菌液的糞便樣品中都有檢出嗜酸乳桿菌LA-G80的存在，灌胃高劑量組菌液大鼠的糞便中菌含量比灌胃低劑量組菌液大鼠糞便中菌含量要高一個數(shù)量級，這與灌胃液高劑量組比低劑量組菌濃高相符合。

圖4 嗜酸乳桿菌LA-G80定植能力

如圖4所示，在停止灌胃1天后，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量均達到最高值，且與各灌胃劑量相符合。隨著停止灌胃后時間的延長，糞便樣品中菌含量總體上呈現(xiàn)減少的趨勢。在停止灌胃3天時，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80比初始灌胃劑量降低2個數(shù)量級。在停止灌胃3～5天時，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量降低很小，基本保持穩(wěn)定，且在停止灌胃7天時，僅下降1個數(shù)量級，仍可保持約105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至對照組水平。

3 結(jié)論

通過灌胃大鼠，采集不同停止灌胃后時間的大鼠糞便，并應(yīng)用Real-time PCR方法快速、準(zhǔn)確地對糞便樣品進行嗜酸乳桿菌LA-G80的定量，從而研究了嗜酸乳桿菌LA-G80的腸道定植能力。研究發(fā)現(xiàn)在停止灌胃1天后，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量達到最高值，且與各灌胃劑量相符合。在停止灌胃3～5天時，糞便樣品中嗜酸乳桿菌LA-G80含量降低很小，基本保持穩(wěn)定，且在停止灌胃7天時，僅下降1個數(shù)量級，仍可保持約105CFU/g，直到停止灌胃9天后菌含量才降至對照組水平，說明嗜酸乳桿菌LA-G80有較好的腸道定植能力，且定植時間約為9天。這可能是由于嗜酸乳桿菌LA-G80本來自于腸道，且對酸有良好的耐受性，而乳酸菌在腸道中定植的首要條件是穿過胃部并保持較大的活菌數(shù)，進而在小腸定植，胃部的強酸環(huán)境會使不耐酸的乳酸菌大量死亡，而嗜酸乳桿菌LA-G80的良好酸耐受性可使其在進入胃部后仍能保持高存活率，并保持高活菌數(shù)進入小腸，進而在小腸定植，發(fā)揮益生功能。