罐組分級逆流提取技術(shù)在娑羅子提取工藝中的應(yīng)用＊

石 沁，葉利春，劉華僑，張曉存，吳 燈，石召華＊＊

（1.武漢理工大學化學化工與生命科學學院 武漢 430070；2.武漢愛民制藥股份有限公司 鄂州436070；3.湖北省天然組分藥物工程技術(shù)研究中心 鄂州 436070）

娑羅子為七葉樹科植物七葉樹Aesculus chinensisBge.、漸江七葉樹AesculuschinensisBge.var.chekiangensis（HuetFang）Fang 或 天 師 栗 Aesculus wilsonii Rehd.的干燥成熟種子。秋季果實成熟時采收，除去果皮，曬干或低溫干燥。為中國藥典收載的中藥[1]。娑羅子主要含有七葉皂苷、脂肪油等成分[2-8]。國內(nèi)外對七葉皂苷的研究報道較多，以婆羅子為原料開發(fā)的藥用制劑主要有七葉皂苷外用凝膠劑、七葉皂苷口服片劑和七葉皂苷鈉注射劑[9]，因此提高娑羅子藥材中七葉皂苷的提取率對于提高生產(chǎn)效率、降低生產(chǎn)成本、實現(xiàn)綠色生產(chǎn)具有重要意義。

傳統(tǒng)中藥提取方法主要包括水煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法、溶劑提取法等[10]。隨著中藥領(lǐng)域的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥提取方法已不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。罐組分級逆流提取[11]（Multi-stage Countercurrent Extraction，MCCE）是集萃取、重滲漉、動態(tài)和逆流技術(shù)為一體的具有多種用途的新型中藥提取工藝。該提取技術(shù)具有工藝簡單、效率高、節(jié)省溶劑、能耗低等優(yōu)點,是一種值得推廣的新技術(shù)、新工藝。本研究運用“動態(tài)循環(huán)階段連續(xù)逆流提取裝置”，以料液比、乙醇濃度、階段提取時間、提取溫度為考察參數(shù)，優(yōu)化最佳提取工藝參數(shù)，并在最佳工藝參數(shù)下比較罐組分級逆流提取技術(shù)和傳統(tǒng)提取技術(shù)，為七葉皂苷提取工藝技術(shù)改造提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（1260，安捷倫）；分析天平（AB265-S，梅特勒）；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限公司）；臺式低速離心機（TD5A-WS，長沙維爾康湘鷹離心機有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9245A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；超高速多功能粉碎機（SZ-2000B-3，永康市善竹貿(mào)易有限公司）；電子調(diào)溫電熱套（98-1-B，天津泰斯特儀器有限公司）。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

1.2 試藥

七葉皂苷鈉對照品（100346-201703，中國食品藥品檢定研究院）；娑羅子藥材（161203F，武漢愛民制藥股份有限公司）；色譜乙腈（17065093，天地）；分析級乙醇、磷酸（均為國藥集團化學試劑有限公司）；純化水（杭州娃哈哈集團有限公司）。

2 試驗方法

2.1 七葉皂苷A、七葉皂苷B含量測定

（1）色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。

以十八烷基鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.2%磷酸水（36∶64）流動相，流速為1 mL·min-1；柱溫為30℃，檢測波長為220 nm，進樣量為10 μL。理論塔板數(shù)按七葉皂苷A峰計算不低于5 000，七葉皂苷A、七葉皂苷B峰的分離度不小于1.5。對照品及供試品對應(yīng)的色譜圖見圖1、圖2。

（2）對照品溶液的制備。

取七葉皂苷鈉對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含有1.5 mg的溶液，即得。

（3）供試品溶液的制備。

取娑羅子粉末1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

（4）線性范圍考察。

取七葉皂苷鈉對照品適量，精密稱定，甲醇溶解配成濃度分別為0.804、0.953、1.214、1.436、1.724 mg·mL-1的混合對照品溶液，分別精密吸取10 μl注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件進行檢測。以峰面積（Y）為縱坐標，以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線。七葉皂苷A的線性回歸方程為Y=23412.34X-1923.27，R2=0.9996；七葉皂苷B的線性回歸方程為Y=24139.25X-1309.63，R2=0.9995。表明七葉皂苷A、七葉皂苷B分別在 0.219～0.587 mg·mL-1、0.236～ 0.489 mg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（5）精密度考察。

取七葉皂苷鈉對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，計算相應(yīng)的RSD值分別為0.09%、0.12%，表明儀器精密度良好。

（6）穩(wěn)定性試驗。

取娑羅子供試品溶液，按上述色譜條件分別于0、4、8、16、24、48 h進樣，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，計算相應(yīng)的RSD值分別為1.07%、1.13%。表明樣品在48小時內(nèi)穩(wěn)定。

（7）重復(fù)性試驗。

取娑羅子樣品粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，依（3）項下分別制備供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣，測定七葉皂苷A、七葉皂苷B的峰面積，根據(jù)線性回歸方程計算含量，所得含量相應(yīng)的RSD值分別為0.84%、0.69%。表明方法具有良好的重現(xiàn)性。

（8）回收率試驗。

取已知含量的娑羅子粉末約1.0 g，共6份，精密稱定，分別精密加入七葉皂苷鈉對照品約75 mg，按（3）項下方法制備供試品溶液，得到6份供試品溶液。按照上述色譜條件進樣，根據(jù)峰面積計算含量，計算平均回收率。七葉皂苷A的平均加樣回收率為99.82%，RSD為0.66%；七葉皂苷B的平均加樣回收率為100.03%，RSD為0.68%。

2.2 出膏率的測定

取娑羅子提取液，濾過，精密量取適量，置于干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴揮干，于105℃干燥3小時，置干燥器中冷卻1小時，迅速稱重，按下述公式計算出出膏率（W1為蒸發(fā)皿恒重與干膏重之和，W2為蒸發(fā)皿恒重，M為藥材質(zhì)量，V1為樣品溶液總體積，V2為量取的藥液體積）。

2.3 罐組分級逆流提取工藝[12～15]

（1）罐組分級逆流提取工藝過程。

第1罐的3次提取為梯度形成階段，即提取3次，每次加入新溶媒，得到提取液A1、A2、A3，其中A1儲存。然后開始逆流提取階段，A2作為第2罐第1次提取的溶媒，得B1，儲存；A3作為第2罐第2次提取的溶媒，得B2；B2作為第3罐第1次提取的溶媒，得C1，儲存；依次循環(huán)提取。每罐最后一次提取，均加入純?nèi)苊健Ｗ詈蠛喜1B1C1C2C3得總提液，其過程見圖3所示。測定總提液中七葉皂苷A和B的含量并計算轉(zhuǎn)移率和出膏率，計算綜合評分。

（2）正交試驗優(yōu)化提取工藝。

在前期預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比、乙醇濃度、階段提取時間、提取溫度為考察因素，以七葉皂苷A+B轉(zhuǎn)移率、干膏得率為主要考察指標，按L9（34）表進行正交試驗?？疾煲蛩嘏c水平見表1，實驗安排與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

運用正交設(shè)計助手Ⅱv3.1設(shè)計正交試驗，綜合評價七葉皂苷A+B轉(zhuǎn)移率和出膏率2個評價指標對提取工藝的影響，其權(quán)重按照8∶2分配，計算綜合得分：

綜合得分/%=((Xi/Xmax)×80%+(Yi/Ymax)×20%)×100

其中，Xmax、Ymax分別為正交試驗結(jié)果中的七葉皂苷A+B收率和干膏得率的最大值。

由表2、表3可知各因素對綜合評分的影響程度為B乙醇濃度＞A料液比＞C提取時間＞D提取溫度，其中，乙醇濃度和料液比對綜合評分有顯著性影響(P＜0.05)。由極值比較可知，四個因素三個水平之間的趨勢分別為A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C1＞C3＞C2，D2＞D3＞D1，故優(yōu)選出的最佳罐組提取工藝為B3A3C1D2，即三罐組條件下藥材粗粉加10倍量70%乙醇以60℃每階段提取20 min。

（3）工藝驗證試驗。

按照優(yōu)選出的最佳提取工藝條件，重復(fù)試驗3次，七葉皂苷A+B轉(zhuǎn)移率和干膏得率結(jié)果見表4。由表4可知，3批提取物的綜合評分分別為97.73、99.04、99.31（RSD為0.85%），說明罐組分級逆流提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

圖3 罐組分級逆流提取過程示意圖

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

（4）與傳統(tǒng)提取方法的比較試驗。取相同量的藥材粗粉，按上述優(yōu)選的罐組分級逆流提取工藝和傳統(tǒng)提取工藝（將藥材粗粉浸泡2 h，過濾，分別加入10-8-8倍量的乙醇回流3次，前1次回流2 h，后2次各回流1 h）進行比較，兩種工藝分別提取3次（n=3），以提取物中七葉皂苷A+B轉(zhuǎn)移率、干膏得率及特征圖譜為指標，比較兩種提取工藝的優(yōu)劣。

表4 工藝驗證試驗結(jié)果

表5 兩種提取方法提取效果比較

表6 兩種提取方法下6批提取物特征圖譜相似度評價

圖4 兩種提取方法下6批提取物的特征圖譜

1）七葉皂苷A+B轉(zhuǎn)移率和干膏得率 試驗結(jié)果見表5。由表5分析可知，與傳統(tǒng)熱回流提取方法相比，采用罐組分級逆流提取法在提高有效成分轉(zhuǎn)移率和出膏率的同時降低了提取溫度、有效節(jié)省溶劑用量，顯著縮短提取周期，提高了提取效率，降低了后期濃縮能耗，具有較大的成本優(yōu)勢。

2）特征圖譜建立及相似度分析 將兩種提取工藝下的6批供試品溶液按2.1.1項下色譜條件測定并建立HPLC指紋圖譜，見圖4。利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A）”，分析各樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜之間的匹配度及相似性，所得相似度結(jié)果見表6，匹配數(shù)據(jù)見表7。

由表6、表7分析可知，6批特征圖譜的相似度均大于0.9，且共有峰個數(shù)均相同，表明兩種提取方法下所得提取物的化學組成及形態(tài)特征高度相似；但是，6批特征圖譜中各共有峰的峰面積有較大差異（除峰3外，其余共有峰的RSD均大于5%，n=6），S1-S3各共有峰的峰面積明顯大于S4-S6中各共有峰的峰面積，表明罐組分級逆流提取對各組分的提取率高于傳統(tǒng)熱回流提取。綜合分析，與傳統(tǒng)熱回流提取方法相比，罐組分級逆流提取法在不改變提取成分的基礎(chǔ)上能明顯提高各個化學成分的提取率。

表7 兩種提取方法下6批提取物特征圖譜匹配數(shù)據(jù)

3 討論

由于使用了罐組分級逆流提取工藝，最大程度提高了乙醇利用率，因而乙醇用量從熱回流工藝的26倍減少到罐組分級逆流提取工藝的18倍，使得生產(chǎn)過程