高效液相色譜法同時測定鼠曲草中槲皮素與木犀草素的含量＊

許贊杉，林小華

（廈門醫(yī)學院藥學系 廈門 361023）

鼠曲草為菊科鼠曲草屬植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥全草，又名清明菜、佛耳草、追骨風、土茵陳等，主要分布在亞洲地區(qū)，以我國和朝鮮、菲律賓等地多見[1]。其性平，味甘，具有化痰止咳、祛風平喘、除濕止痹之功效，主治感冒咳嗽、支氣管炎、哮喘、高血壓、蠶豆病、風濕腰腿痛等[2-3]。另一方面，鼠曲草自古以來就一直作為野菜而被人們食用[4]。有研究表明，鼠曲草中含有二萜類、生物堿和黃酮等化合物，其中黃酮類為主要活性成分[5-7]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有抗氧化、抗過敏、抗炎、抗菌、抗突變、抗腫瘤、保肝作用，具有保護心腦血管系統(tǒng)和抗病毒等廣泛的生理活性[8-9]。目前關于鼠曲草化學成分含量測定的研究報道較少，僅見槲皮素的測定[10]，為深入挖掘我國寶貴的中藥資源，本實驗采用HPLC法，同時測定鼠曲草中槲皮素和木犀草素含量，該方法簡便準確，可以用來更好地控制和完善鼠曲草藥材的質(zhì)量標準。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

美國Waters e2695高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、在線真空脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、2998二極管陣列檢測器），Empower色譜工作站；SY25-1200型超聲波清洗器（張家港市三友超音設備廠）；RT-04型多功能粉碎機（臺灣鴻翔藥材器械廠）；XPE105型電子太平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；DHG型鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-S型水浴鍋（上海君竺儀器制造有限公司）；0.45 μm微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司）。

1.2 試藥

槲皮素對照品（含量98%，批號C20J6Y1722，上海源葉生物科技有限公司）；木犀草素對照品（含量98%，批號Y01D656815，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；磷酸（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水（自制）；其他試劑均為分析純。鼠曲草采摘于廈門汀溪水庫、東嶺水庫和坂頭水庫，經(jīng)廈門醫(yī)學院中藥教研室向云亞老師鑒定為菊科植物黃花鼠曲草的全草。

圖1 對照品混合溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18(2)（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（42:58）；檢測波長：360 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。在此色譜條件下，槲皮素和木犀草素均達到基線分離（R＞1.5），理論塔板數(shù)均不低于4 000，分離色譜見圖1、圖2。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取槲皮素與木犀草素對照品各17.94 mg、6.47 mg，分別置10 mL量瓶中，各加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含1794 μg的槲皮素對照品儲備液和每1 mL含647 μg的木犀草素對照品儲備液。精密吸取上述2種對照品儲備液各2 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取鼠曲草粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用60%乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液各0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成不同濃度的混合對照品溶液。取上述對照品混合溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣并測定，以質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得槲皮素的回歸方程為Y=664 19X+187 63（R2=0.999 6），木犀草素的回歸方程為Y=762 59X+5 987（R2=0.999 4），表明槲皮素質(zhì)量濃度在3.588-35.880 μg·mL-1（R2=0.999 6）范圍內(nèi)線性關系良好，木犀草素質(zhì)量濃度在1.294-12.940 μg·mL-1（R2=0.999 4）范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗

精密吸取含槲皮素 21.528 μg·mL-1、木犀草素7.764 μg·mL-1的混合對照品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件，重復進樣6次，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.62%(n=6)、2.46%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗

取按“2.2.2”項下制備條件制成的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為0.71%(n=6)、0.78%(n=6)，結果表明槲皮素和木犀草素的量均未發(fā)生明顯的改變，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復性實驗

精密稱取同一鼠曲草樣品粉末6份，每份約2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算其RSD。結果槲皮素、木犀草素峰面積的RSD分別為1.38%(n=6)、1.15%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的鼠曲草樣品粉末6份，每份約1 g，分別精密加入一定量的槲皮素和木犀草素對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算加樣回收率，測得量帶入“2.3.1”項下線性方程中，顯示在線性范圍內(nèi)，結果見表1。

2.4 樣品含量測定

精密稱取3個不同產(chǎn)地的鼠曲草藥材粉末各2 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，用外標法計算各樣品中槲皮素和木犀草素的含有量，結果見表2。

3 討論

3.1 流速的選擇

本實驗分別在0.8、0.9、1.0mL·min-13個流速下對樣品進行分析，結果顯示在流速為1.0 mL·min-1時，槲皮素和木犀草素的分離效果較佳，故選取此流速為最佳流速。

3.2 柱溫的選擇

我們考察了25、30、35℃3個柱溫，在其他色譜條件相同的情況下進樣分析，考察基線、峰形、出峰時間等參數(shù)，以確定最合適的柱溫。結果顯示柱溫在30℃時，槲皮素和木犀草素的分離效果較佳，均能夠達到基線分離，故選此柱溫為最佳柱溫。

3.3 色譜柱的選擇

本實驗選用了不同色譜柱進行比較：Agilent SBC18（4.6 mm×150 mm,5 μm)、Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Inertsil ODS-3(4.6 mm×250 mm,5 μm)以及Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)。結果顯示Diamonsil C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱響應值最好，樣品各組分分離度好，故選用其作為本實驗的色譜柱。

3.4 檢測波長的選擇

本實驗采用二極管陣列檢測器在190-400 nm波長進行掃描，結果發(fā)現(xiàn)槲皮素在254 nm和364 nm處有最大紫外吸收，木犀草素在253 nm和350 nm處有最大紫外吸收（見圖3、圖4）。因此我們考察了不同吸收波長（254 nm、350 nm、360 nm）的吸收圖譜，發(fā)現(xiàn)在360 nm處兩者均有較強吸收并且干擾很少，圖譜特征性強，故選取360 nm作為本實驗的檢測波長。

3.5 流動相的選擇

根據(jù)文獻[11-12]，對比考察了乙腈-0.1%乙酸溶液（25∶75）、甲醇-0.2%磷酸溶液（45∶55）、甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）3種流動相，并考察了梯度洗脫模式，觀察樣品中槲皮素和木犀草素的分離情況。結果表明，選擇甲醇-0.4%磷酸溶液（42∶58）為流動相時槲皮素和木犀草素的響應值好，峰形良好，理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等均符合要求。

表1 加樣回收率試驗結果（n=6）

表2 樣品含量測定結果（n=3）

圖3 槲皮素紫外吸收光譜圖

圖4 木犀草素紫外吸收光譜圖

3.6 提取方法的選擇

本實驗考察了直接超聲提取和石油醚索氏提取后超聲提取兩種方法，結果表明兩種方法測得的含量基本無差異，故選擇直接超聲提取法；提取溶劑的選擇我們比較了不同濃度的甲醇（60%甲醇、75%甲醇、80%甲醇）和不同濃度的乙醇（60%乙醇、75%乙醇、80%乙醇）的提取效率，結果表明用60%乙醇提取效果最好；同時考察了超聲提取15 min、30 min和45 min，結果表明超聲提取15 min未能提取完全，而超聲提取30 min與 45 min基本無差異，故選擇超聲提取30 min的提取方法。根據(jù)實驗結果最終確定樣品的提取方法為采用60%乙醇超聲提取30 min。

3.7 不同產(chǎn)地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的比較

由表2可以看出，不同產(chǎn)地的鼠曲草中槲皮素和木犀草素的含量不同，槲皮素在0.39-0.58 mg·g-1之間，木犀草素在0.17-0.27 mg·g-1之間，有一定的波動。二者均以汀溪水庫為最高，坂頭水庫次之，東嶺水庫最低，這可能與鼠曲草的產(chǎn)地環(huán)境、氣候溫度、生長方式、采摘時間等因素有密切關系。因此，從黃酮類成分的資源利用角度來看，汀溪水庫的鼠曲草質(zhì)量最好，故建議在以鼠曲草作為藥源時應考慮同種藥材不同產(chǎn)地的含量差異。

綜上，該方法簡便快速、準確可靠、重現(xiàn)、精密度、穩(wěn)定性、回收率都較好，可以用來更好地控制和完善鼠曲草藥材的質(zhì)量標準。