倍半萜內(nèi)酯減輕糖尿病小鼠胰島素抵抗及早期腎損傷

邱 維，張 薇，陶建瓴，王海云，鄭法雷，李雪梅

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100730)

近年來以胰島素抵抗為特點的2型糖尿病發(fā)病率不斷上升[1]。糖尿病腎病是發(fā)達國家最常見的終末期腎病病因，在中國患病率亦快速增長[2]。糖尿病腎病具體機制遠未探明[3]，傳統(tǒng)的降糖、降壓、降脂無法從根本上改善糖尿病腎病的預(yù)后。近來慢性低度炎性反應(yīng)在胰島素抵抗的作用日益受重視[4]，能否通過抑制全身及腎臟局部慢性炎性反應(yīng)、改善胰島素抵抗，從而延緩糖尿病腎病進展是本研究擬探討的問題。

倍半萜內(nèi)酯/小白菊內(nèi)酯(sesquiterpene lactones, pathenolide,PTN)是從菊科植物中提取的一種活性成分，可抑制NF-κB活性從而起到抗炎作用[5]。PTN 能否通過抑制炎性反應(yīng)、改善胰島素抵抗從而延緩糖尿病腎病進展目前尚未見報道。本研究以瘦素(leptin)受體基因缺陷導(dǎo)致的先天性2型糖尿病模型-C57BKS db/db小鼠為實驗對象[6]，觀察不同時間點小鼠代謝指標、慢性炎性反應(yīng)和胰島素抵抗以及腎臟損傷情況，以及糖尿病腎病機制及的倍半萜內(nèi)酯治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級42只雄性C57BKS db/db小鼠與15只雄性db/m小鼠 [南京大學(xué)模式動物研究中心，SCKX(蘇)2010-0001]，飼于北京協(xié)和醫(yī)院動物研究中心，動物SPF級屏障環(huán)境，12 h 交替照明，隨機分籠、顆粒飼料喂養(yǎng)、自由攝水。

1.1.2 藥物與試劑：倍半萜內(nèi)酯(parthenolide)(Sigma-Aldrich公司)； 兔抗鼠MCP-1(monocyte chemotactic protein 1)多克隆抗體(Abcam公司)； 羊抗鼠NF-κB多克隆抗體(Santa Cruz公司)；MCP-1、IL-6 ELISA試劑盒(Rapidbio公司)。

1.2 方法

1.2.1 隨機分組：1)對照組(db/m組，n=15)；2)實驗組(db/db組，n=21)；3，干預(yù)組(db/db+PTN組，n=21)；3)db/db+PTN組于8周末起予PTN(1.0 mg/kg 隔日一次)腹腔注射，對照及實驗組予0.9%氯化鈉溶液隔日一次腹腔注射，分批于8、12及16周處死及留取標本。

1.2.2 標本留取及測定：以摘除小鼠眼球法留取血清，以酶法測定相關(guān)血清生化指標，以代謝籠收集24 h尿液，以免疫透射比濁法測定尿白蛋白，碘[125I]放射免疫法測定胰島素，ELISA測定血清MCP-1、IL-6含量。計算胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=FBG(mmol/L)×FINS (mIU/L)/22.5，F(xiàn)BG為空腹血糖，F(xiàn)INS為空腹血胰島素。取肝腎組織置于10%多聚甲醛固定，切片行HE染色，腎臟另行PAS染色。

1.2.3 腎臟免疫組化染色：選取圖像導(dǎo)入Image-Pro Plus 6.0軟件進行半定量分析，MCP-1：隨機選取光學(xué)顯微鏡200×鏡下15個視野的腎小管間質(zhì)，分析每個視野的積分吸光度值(IA)，計算均值。NF-кB: 隨機選取光學(xué)顯微鏡400×鏡下20個視野的腎小球，隨機取20個腎小球，分析每個視野下陽性染色細胞占腎小球細胞總數(shù)的百分比，計算均值進行比較。

1.2.4 腎臟PAS染色：應(yīng)用ipp6.0軟件處理，以db/db小鼠的單位腎小球面積(以ipp軟件象素數(shù)目為面積單位)作為衡量腎小球肥大的指標，以db/db小鼠系膜基質(zhì)積分吸光度值(IA)作為衡量系膜基質(zhì)擴張的指標。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PTN改善小鼠生化代謝指標

16周db/db組較對db/m組出現(xiàn)肥胖、多食多尿及活躍程度偏低，質(zhì)量、血脂、血糖升高、胰島素分泌增加(表1，2)及脂肪肝程度加重。16周db/db+PTN組TC較db/db組顯著下降(P<0.05)。

2.2 PTN改善小鼠全身胰島素抵抗

16周db/db+PTN組小鼠的HOMA-IR較db/db小鼠有顯著下降(P<0.05)(表3)。

2.3 PTN降低循環(huán)及腎臟炎性反應(yīng)

2.3.1 循環(huán)炎性因子：12周db/db+PTN組小鼠的血清MCP-1與IL-6水平較db/db組顯著下降(P<0.05)(表4，5)。

表1 16周齡小鼠糖代謝指標Table 1 Metabolic index in 16 week-old

#P<0.05 ompared with db/m group.

表2 16周齡小鼠脂代謝指標

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 ompared with db/db group.

表3 各組小鼠HOMA-IR指標

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group

表4 各組小鼠血清MCP-1變化

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

表5 各組小鼠血清IL-6變化

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

2.3.2 腎臟炎性因子：各周齡db/db組腎臟NF-кB陽性表達比例及MCP-1表達較db/m組均有顯著上升。12周db/db+PTN組的NF-кB陽性表達比例較db/db小鼠顯著下降(P<0.05)。12周db/db+PTN組的MCP-1表達較db/db小鼠顯著下降(P<0.05)(圖1)。

圖1 各組小鼠治療前后腎小球NF-кB陽性染色情況Fig 1 NF-кB positive proportion in glomerular before and after treatment

#P<0.05 compared with db/m group; *P<0.05compared with db/db group圖2 各組小鼠治療前后腎小球NF-кB陽性比例Fig 2 NF-кB positive proportion in glomerular before and after treatment

#P<0.05 compared with db/m group; *P<0.05compared with db/db group圖3 治療前后MCP-1陽性區(qū)域IA值Fig 3 A value of MCP-1 positive region before and after treatment

圖4 各組小鼠腎小管MCP-1組化染色Fig 4 MCP-1 staining of renal tubules in each group of mice

2.4 PTN改善小鼠脂肪肝及糖尿病腎病預(yù)后

2.4.1 腎臟生化指標：db/db組U-ACR顯著高于db/m組(P<0.05)。db/db+PTN組與db/db組相比，尿量、血肌酐、U-ACR無差異(表6)。

2.4.2 肝臟病理：db/db小鼠存在嚴重的肝臟脂肪化；經(jīng)PTN治療后16周小鼠肝臟脂肪化程度減輕，肝小葉大部分細胞未見嚴重空泡樣變，細胞腫脹程度減輕，排列較為規(guī)則(HE×200)(圖5)。

表6 16周小鼠生化指標Table 6 Biochemical indexes in16 week-old mice

#P<0.05 compared with db/m group.

圖5 16周小鼠PTN治療前后肝臟病理Fig 5 Liver pathology in 16 week old mice before and after PTN treatment

圖6 16周各組小鼠腎臟PAS染色Fig 6 Pathological changes of kidney in 16 week-old mice before and after PTN treatment(PAS)

2.4.3 腎臟病理：PAS(×200)染色下，16周db/db組腎組織光鏡下可見腎小球肥大、系膜基質(zhì)擴張及染色加深。db/db+PTN組腎小球肥大及系膜擴張較db/db組減輕(圖6)。

db/db組腎小球面積在各時間點顯著大于db/m組(P<0.05)，16周db/db+PTN組的單位腎小球面積較db/db組顯著下降(P<0.05)(表7)。

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

db/db組系膜基質(zhì)IA值在各時間點顯著高于db/m組(P<0.05)；db/db+PTN組的系膜基質(zhì)IA值較db/db組在12周、16周顯著下降(P<0.05)(表8)。

表8 各組小鼠系膜基質(zhì)IA值

#P<0.05 compared with db/m group;*P<0.05 compared with db/db group.

3 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的突出特征，與慢性非特異性炎性反應(yīng)有密切關(guān)聯(lián)[4]。高脂血癥、高血糖、氧化應(yīng)激可導(dǎo)致炎性反應(yīng)信號通路在脂肪組織中的活化[7]，目前針對炎性因子相關(guān)的藥物干預(yù),許多已被證實可改善糖尿病腎病預(yù)后[8-9]。

在NF-κB信號通路中，IκK可使IR與IRS-1 Ser磷酸化[10]，而下游TNF-α、IL-β1、IL-6均可通過各自途徑，同樣可阻礙正常的IRS-1酪氨酸磷酸化而導(dǎo)致胰島素抵抗[3-11]。本研究中12周 db/db+PTN組的血清MCP-1與IL-6水平較db/db組顯著下降，證實PTN也可減少循環(huán)中NF-κB以外的炎性因子。腎臟局部炎性因子與循環(huán)因子有相似之處[12]。db/db+PTN組的腎臟NF-κB與MCP-1表達水平下降；其HOMA-IR在12、16周較db/db組有下降趨勢，進一步證實了胰島素抵抗改善與炎性反應(yīng)抑制相關(guān)。而在16周db/db+PTN組的腎小球肥大及系膜基質(zhì)擴張有所改善，說明PTN可引起慢性炎性反應(yīng)抑制及胰島素抵抗改善，進而延緩糖尿病腎病的病理進展。本研究中db/db鼠MCP-1與IL-6的指標在12周達峰后、于16周卻有所下降。這也是引起16周db/db+PTN組炎性因子改善不明顯的原因之一。另外，db/db小鼠的血糖及胰島素水平隨周齡增長，至10～12周進入平臺期，此時腎臟僅有早期系膜擴張及基質(zhì)增生，至24周db/db小鼠腎臟病理電鏡下才可出現(xiàn)線粒體變形、脂滴減少、細胞核變形、染色質(zhì)邊集等異常[6]。因此抑制炎性反應(yīng)的益處可能需要更長時間積累才可充分體現(xiàn)。

脂類代謝異常被認為是影響胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要環(huán)節(jié)。肝臟脂質(zhì)異位積累可損害胰島素的調(diào)節(jié)能力、激活糖異生和糖原的合成[13]。db/db+PTN組小鼠TC水平有所下降、脂肪肝程度減輕。這說明PTN對減輕脂代謝異常從而改善胰島素抵抗可能有積極作用。在肥胖的小鼠，脂肪細胞可分泌大量MCP-1，作為一種趨化因子募集巨噬細胞到脂肪組織，加劇慢性炎性反應(yīng)的進展[12-14]。從機制上看，小鼠肝臟脂肪組織中的炎性反應(yīng)與巨噬細胞的作用可能相關(guān)。本研究主要著眼于腎臟疾病及預(yù)后，其肝臟局部機制仍有待于進一步試驗研究。