miR-185在妊娠合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的T細(xì)胞異常甲基化中的作用及分子機(jī)制

劉恩令，劉 錚，周玉秀，張冬紅，陳 梅

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000; 2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科，天津 300052; 3.河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科， 河北 唐山 063000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種累及多個(gè)器官的慢性自身免疫性疾病。SLE主要在女性群體中發(fā)病[1]。雖然遺傳、種族、激素和環(huán)境因素等都會影響到SLE的發(fā)生發(fā)展，但SLE的確切致病機(jī)制仍不十分明確[2-3]。最近報(bào)道，miR-185可以直接靶向作用于DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)，從而導(dǎo)致全基因組甲基化(global DNA methylation,GDM)的減少和調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中啟動子-超甲基化基因的表達(dá)[4]。然而，miR-185如何通過調(diào)控DNMT1的表達(dá)和基因組DNA甲基化，從而影響SLE的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚無系統(tǒng)的探討。本研究的主要目的是闡明miR-185在SLE患者的T細(xì)胞異常甲基化中所起的作用及潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試者: 實(shí)驗(yàn)組為20例患有SLE的妊娠女性患者，平均年齡(31.9±10.7)歲。對照組為20名健康的女性志愿者，平均年齡(31.2±11.4)歲，所有患者都符合美國風(fēng)濕病學(xué)會的SLE分類標(biāo)準(zhǔn), 用SLE疾病活動指數(shù)(SLEDAI)評估SLE活性, 所有參與者都來自中國漢族人群, 合并感染者被排除在研究之外。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山市工人醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并經(jīng)患者知情同意。收集所有受試者外周血樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.1.2 試劑: 磁珠(Miltenyi Biotec公司); 人T細(xì)胞Nucleofector試劑盒、 Trizol試劑(Life Technologies公司);PrimeScript RT Master Mix和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、miR-185和U6的引物(Genepharm公司); 硝酸纖維素膜(Millipore)(Bedford公司);Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)(E1960)(Promega公司);MethyflashTMDNA甲基化定量試劑盒(Epigentek公司)；抗DNMT1抗體、CD11a、CD70和β-肌動蛋白抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 T細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染: 通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心分離外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)。通過磁珠陽性選擇分離法分離CD4+T細(xì)胞，通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)進(jìn)行純度評估(純度為95.5%±1.2%)。分離得到的細(xì)胞在AIM V無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用人T細(xì)胞Nucleofector試劑盒和Amaxa核轉(zhuǎn)染技術(shù)(V-24程序)，用FAM標(biāo)記的miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞。核轉(zhuǎn)染后48 h分析DNMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)，核轉(zhuǎn)染后72 h檢測甲基化敏感性基因的水平。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR): 使用Trizol試劑按照說明書從細(xì)胞系中提取總RNA。使用PrimeScript RT Master Mix和SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR試劑盒分別進(jìn)行mRNA和miRNA的反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR。所有反應(yīng)都進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。通過U6和β-肌動蛋白對miRNA進(jìn)行定量。使用2-△△Ct方法計(jì)算相對表達(dá)水平。引物如下：DNMT1上游引物：5′-CG-GTTCTTCCTCCTGGAGA ATGTCA-3′，下游引物：5′-CACTGATAGCCCATGCG GACCA-3′；β-肌動蛋白上游引物：5′-GCACCACACC TTCTACAATGAGC-3′，下游引物：5′-GGATAGCACA GCCTGGATAGCAAC-3′。

1.2.3 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡分析: 將細(xì)胞在補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中置冰上裂解30 min。4 ℃，10 000×g，離心10 min至裂解液澄清。通過10% SDS-PAGE凝膠電泳分離等量的蛋白質(zhì)，并通過電轉(zhuǎn)將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在含有0.1% Tween-20的Tris中用5%(w/v)脫脂牛奶封閉硝酸纖維素膜。將膜與抗待檢蛋白抗體(一抗)反應(yīng)過夜，與共價(jià)結(jié)合有HRP的二抗在室溫條件下反應(yīng)1 h。用ECL技術(shù)觀察條帶。使用Quantity One軟件(Bio-Rad)定量相對表達(dá)水平。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn): 為了確定DNMT1是否是miR-185的直接靶標(biāo)，本研究構(gòu)建了熒光素酶質(zhì)粒，質(zhì)粒中包含有3′-UTR(非翻譯區(qū))片段的miR-185可能的靶序列及下游區(qū)的熒光素酶基因。使用Dual-Glo熒光素酶測定系統(tǒng)測定裂解物，通過光度計(jì)進(jìn)行定量。

1.2.5 DNA提取和全基因組DNA甲基化檢測: 使用All Prep DNA/RNA/Protein Mini試劑盒按照說明書中的方案從CD4+T細(xì)胞中提取基因組DNA。使用MethyflashTMDNA甲基化定量試劑盒評估CD4+T細(xì)胞中DNA的全基因組甲基化水平。全基因組甲基化比率在結(jié)果中展示(甲基化%)。

1.2.6 亞硫酸氫鈉法測序: 使用QIAamp DNA Blood Midi試劑盒從miRNA轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中分離基因組DNA，然后使用Imprint DNA修飾試劑盒用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA?；趤喠蛩釟潲}轉(zhuǎn)化的PCR引物用MethPrimer程序設(shè)計(jì)：CD70上游引物：5′-GAGGTTATGAATTTTGGGAGGATAT-3′，下游引物：5′-TCCCATCTCAACCTTTTACATAATTA-3′; CD11a上游引物：5′-GTTATTTAGGTAGGAGTGTA GTGGTA-3′，下游引物：5′-ACAAATCAACTAAAATC AAAAATTC-3′。使用Wizard DNA Clean-up System(Promega公司)純化PCR產(chǎn)物，然后克隆到pGEM-T Easy載體Ⅰ(Promega)中。每個(gè)樣本中均選取8個(gè)獨(dú)立的克隆，并使用T7和Sp6引物對插入的片段進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 妊娠合并SLE患者的CD4+ T細(xì)胞中miR-185表達(dá)與DNMT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

妊娠合并SLE患者的CD4+T細(xì)胞中miR-185表達(dá)水平顯著高于健康對照者(圖1A)(P<0.01)，而DNMT1的結(jié)果正好相反(圖1B)(P<0.01)。此外，miR-185的表達(dá)量與DNMT1表達(dá)量之間呈非常顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖1C)(r=-0.8432，P<0.0001)。

2.2 miR-185的靶標(biāo)DNMT1

根據(jù)miR-185表達(dá)水平的顯著變化(圖2B, 2C)，miR-185能夠明顯抑制攜帶野生型3′-UTR的DNMT1報(bào)告載體的活性；而攜帶突變miR-185潛在3′-UTR區(qū)域結(jié)合位點(diǎn)的載體，miR-185的作用受到了明顯的抑制(圖2D)(P<0.01)。miR-185的過表達(dá)會顯著降低DNMT1的蛋白水平(P<0.01)，而敲除miR-185則促進(jìn)了DNMT1蛋白水平的提高(圖2E,F,G)(P<0.01)。

2.3 miR-185的過表達(dá)降低全基因組DNA甲基化且誘導(dǎo)CD11a和CD70的表達(dá)

如圖3A所示，miR-185的上調(diào)降低全基因組DNA甲基化水平，并且增加CD11a和CD70的mRNA(圖3C)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平(圖3D)(P<0.05)。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD11a和CD70啟動子的甲基化水平顯著降低(圖3B)(P<0.05)，這與兩種基因的mRNA和蛋白表達(dá)增加一致。

A.expression of miR-185 in SLE and control group；B.expression of DNMT1 in SLE and control group; C.expression and correlation analysis of miR-185 and DNMT1

圖1miR-185和DNMT1的表達(dá)及相關(guān)性分析
Fig1ExpressionandcorrelationanalysisofmiR-185andDNMT1

A.luciferase reporter gene construction; B.expression of miR-185 after treatment with mimics; C.expression of miR-185 after treatment with inhibitor; D.effects on the activity of luciferase of miR-185 mimics and inhibitor; E.expression of DNMT1 after treatment with mimics; F.expression of DNMT1 after treatment with inhibitor；G.quantitative analysis of Western blot with BandScan 5.0 software

2.4 miR-185敲除可潛在降低妊娠合并SLE患者的CD4+ T細(xì)胞的低甲基化

miR-185抑制劑轉(zhuǎn)染SLE患者的CD4+T細(xì)胞72 h后，CD11a和CD70啟動子DNA(圖4A)和全基因組DNA(圖4B)的甲基化水平顯著增加(P<0.05)，這兩個(gè)基因的mRNA(圖4C)和蛋白質(zhì)水平(圖4D)顯著降低(P<0.05)。

3 討論

DNA甲基化是染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本決定因素，對基因表達(dá)具有有效的抑制作用。最近的研究表明，T細(xì)胞DNA去甲基化在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[5]。更多數(shù)據(jù)表明，SLE患者的T細(xì)胞中DNA轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的表達(dá)明顯減少[6]。DNA甲基化抑制劑如5-氮雜胞苷可誘導(dǎo)小鼠的T細(xì)胞發(fā)生自身免疫，表現(xiàn)出狼瘡癥狀[7]。此外，藥物誘導(dǎo)的狼瘡與DNA甲基化和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的異常表達(dá)相關(guān)[8]。DNMTs是基因組甲基化狀態(tài)和強(qiáng)度的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。目前，已經(jīng)確定了3種具有催化活性的DNMT1，即DNMT、DNMT3A和DNMT3B[9]。DNMT1是基礎(chǔ)性表達(dá)基因，在DNA復(fù)制期間負(fù)責(zé)DNA甲基化的正常進(jìn)行。本研究通過檢測妊娠合并SLE患者的T細(xì)胞樣本，發(fā)現(xiàn)miR-185在CD4+細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)。從機(jī)制上看，miR-185與SLE中的DNA低甲基化有關(guān)，通過直接抑制DNMT1的表達(dá)參與SLE的發(fā)病機(jī)制。

A.effect on the average methylation level in the promoter region of CD11a and CD70 of miR-185 mimics or negative control transfection；B.effect on the global DNA methylation status of miR-185 mimics; C.effect on the mRNA expression of CD11a and CD70 of miR-185 mimics; D.effects on the protein expression of CD11a and CD70 of miR-185 mimics

圖3miR-185的表達(dá)和CD11a和CD70啟動子DNA的低甲基化導(dǎo)致CD11a和CD70表達(dá)增加

A.effect on the average methylation level in the promoter region of CD11a and CD70 of miR-185 inhibitor or negative control transfection；B.effect of miR-185 inhibitor on the DNA methylation status of the global DNA of miR-185 inhibitor; C.effect on the expression of mRNA in CD11a and CD70 of miR-185 inhibitor; D.effect on the protein expression of CD11a and CD70 of miR-185 inhibitor

最近Dai Y等人對比SLE患者和健康人的PBMC，發(fā)現(xiàn)其中一部分miRNA發(fā)生了失調(diào)[10]。miR-146a可通過抑制SLE患者PBMC中的IFN信號通路來調(diào)節(jié)SLE的進(jìn)展[11]。同時(shí)，部分miRNA可直接與DNMT1的3′-UTR區(qū)域結(jié)合，從而抑制其在狼瘡患者的CD4+T細(xì)胞中的表達(dá)，如miR-126、miR-148a和miR-21[12-13]。此外，人T細(xì)胞中miR-29b的上調(diào)會抑制SP1表達(dá)，這就說明其可抑制DNMT1的表達(dá)并調(diào)節(jié)DNA甲基化。也有更深入的研究顯示，在SLE患者的T細(xì)胞中抑制miR-29b可逆轉(zhuǎn)DNA低甲基化且上調(diào)下游基因[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，來自健康對照的CD4+T細(xì)胞中，miR-185的過表達(dá)會導(dǎo)致全基因組DNA和CD11a和CD70基因啟動子甲基化程度下調(diào)，其他相關(guān)基因的上調(diào)。如果敲除SLE患者CD4+T細(xì)胞中的miR-185，會提高DNMT1的表達(dá)，降低甲基化敏感性基因的表達(dá)。

總之，綜合整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，干預(yù)miR-185的表達(dá)水平可為SLE的干預(yù)治療提供新的有潛在研究價(jià)值的治療策略。對基因敲除和轉(zhuǎn)基因動物模型的進(jìn)一步研究將有助于確定miR-185在自身免疫性疾病中所起的作用。