便秘型腸易激綜合征大鼠結腸黏膜下神經(jīng)元的變化

費貴軍，胡福境,，樊文娟，梁列新，方秀才*

(1.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 消化內科，北京 100730；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 消化內科， 廣西 南寧 530021)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種以腹痛或腹部不適伴隨糞便性狀改變和/或排便習慣改變的功能性腸病，臨床上主要根據(jù)癥狀學標準進行診斷。依據(jù)羅馬IV診斷標準[1]，將IBS分為腹瀉型、便秘型、混合型和未定型，其發(fā)病機制尚未明確。腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)是調節(jié)胃腸道感覺、運動和分泌等復雜功能協(xié)調運行的基礎。目前IBS發(fā)病機制中腸道動力異常研究較多，而從ENS的角度進行黏膜分泌相關的研究很少。本研究采用冰水灌胃法建立便秘型IBS(IBS with constipation，IBS-C)大鼠模型，應用免疫熒光多重染色技術檢測大鼠結腸黏膜下神經(jīng)叢(submucosal plexus，SMP)中興奮性分泌運動神經(jīng)元[膽堿乙酰轉移酶即ChAT免疫反應(immunoreactivity，IR)陽性神經(jīng)元和血管活性腸肽即VIP-IR(vasoactive intestinal palypeptide-IR)陽性神經(jīng)元]和抑制性神經(jīng)元[一氧化氮合酶即NOS-IR(nitric oxide synthase-IR)陽性神經(jīng)元]的活化狀態(tài)，探討ENS在IBS-C發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級雄性Wistar大鼠，體質量為140～150 g[北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK(京)2012- 0001]。

1.1.2 試劑：一抗：抗神經(jīng)核抗體Anti-Hu (Abcam公司)；抗c-fos抗體和抗VIP抗體(Santa Cruz公司)；抗 ChAT抗體和抗NOS抗體(Chemicon公司)。二抗： TRITC-驢抗小鼠IgG、DyLight405-驢抗兔IgG和FITC-驢抗山羊IgG(Jackson公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理：將大鼠分為對照組和IBS-C模型組。參考文獻[2]應用冰水灌胃法建立IBS-C模型。

1.2.2 糞便性狀檢測：計數(shù)2組大鼠糞便顆粒數(shù)，稱干濕質量，計算糞便含水量。大鼠出現(xiàn)糞便顆粒數(shù)和糞便含水量下降，認為IBS-C造模成功。

1.2.3 腸道傳輸功能測定：大鼠禁食24 h后，予每只大鼠10%活性炭混懸液2 mL灌胃。6 h后頸椎脫臼法處死大鼠，將幽門至直腸末端完整取出，測量腸道的全長和炭末混懸液在腸道內推進的距離。計算腸道內活性炭末通過率：活性炭末混懸液推進長度/腸道全長×100%。

1.2.4 SMP全層鋪片標本的解剖制備：取距肛門6～9 cm遠端結腸組織，剖開平鋪后于室溫下中性福爾馬林溶液浸泡固定至少24 h。漂洗標本后，在解剖顯微鏡下，用顯微分離器械小心地逐層剝除黏膜層、縱行肌和環(huán)形肌肌束，所得的黏膜下層組織即含有完整SMP的全層鋪片標本。

1.2.5 免疫熒光三重染色法：磷酸鹽緩沖液漂洗制備好的結腸SMP全層鋪片標本，用驢血清封閉2 h。加抗神經(jīng)核抗體(Anti-Hu，1∶100)/ Anti c-fos(1∶100)/抗 ChAT一抗(1∶100)或抗VIP一抗(1∶100)或抗NOS一抗(1∶100)混合液孵育，室溫過夜；漂洗后加二抗即TRITC標記驢抗小鼠IgG(1∶300)、DyLight405標記驢抗兔IgG(1∶100)和FITC標記驢抗山羊IgG(1∶300)混合液，4℃避光孵育1 h。然后按常規(guī)步驟進行漂洗和封片。

1.2.6 熒光顯微鏡(Nikon eclipse 80i)觀察計數(shù)：每只大鼠分別取6張結腸SMP全層鋪片標本，從每張標本中隨機選取5個不重疊高倍視野(10×20)，計數(shù)每個高倍視野中SMP的神經(jīng)節(jié)數(shù)、SMP神經(jīng)元總數(shù)(以Anti-Hu-IR陽性為標志)、特異性SMP神經(jīng)元數(shù)(即ChAT-IR陽性神經(jīng)元、VIP-IR陽性神經(jīng)元和NOS-IR陽性神經(jīng)元)；以c-fos-IR陽性作為神經(jīng)元活化標志，計數(shù)相應的活化神經(jīng)元數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 冰水灌胃后大鼠糞便顆粒數(shù)及含水量變化

模型組體質量增長緩慢，糞便顆粒數(shù)減少的同時，糞便含水量較對照組顯著下降(P<0.01)(圖1)。

2.2 IBS-C模型組大鼠腸道傳輸減慢

IBS-C模型大鼠活性炭懸濁液在全腸道中通過率為87.1%±3.8%，顯著低于對照組的92.6%±5.0%(P<0.05)。

2.3 模型組大鼠結腸SMP中神經(jīng)元的變化

神經(jīng)元總數(shù)和活化神經(jīng)元數(shù)顯著增多(表1)。

2.4 模型組大鼠結腸SMP中膽堿能神經(jīng)元的變化

活化的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量和比例顯著降低(表2)。

2.5 模型組大鼠結腸SMP中VIP能神經(jīng)元的變化

活化的VIP能神經(jīng)元比例顯著降低(表3)。

2.6 模型組大鼠結腸SMP中氮能神經(jīng)元的變化

NOS-IR陽性神經(jīng)元總數(shù)以及其活化的數(shù)量和比例明顯增高(表4)。

3 討論

IBS發(fā)病機制涉及動力、感覺、腦-腸軸和黏膜通透性等， 其中ENS的作用受到高度重視[1]。ENS肌間神經(jīng)叢主要調控腸道運動功能，黏膜下神經(jīng)叢(SMP)主要調控黏膜分泌功能。IBS-C模型 SMP內興奮性和抑制性神經(jīng)遞質表達有變化[3]；IBS患者乙狀結腸黏膜及血漿VIP含量升高，VIP表達上調[4]。而有關IBS的SMP神經(jīng)元活化狀態(tài)的研究鮮見報道。本研究以c-fos作為神經(jīng)元活化標志物[5]，發(fā)現(xiàn)IBS模型大鼠多種SMP神經(jīng)元活化狀態(tài)出現(xiàn)明顯變化，存在神經(jīng)可塑性。

*P<0.05 compared with control圖1 大鼠糞便顆粒數(shù)及含水量變化趨勢Fig 1 Changes of number of fecal granules and water content of feces in n=7)

groupganglia/HPFneurons/HPFactivated neurons/HPFcontrol5.0±1.436.1±9.819.9±9.6model6.0±2.9*44.4±17.5*24.3±12.7*

HPF:high power field;*P<0.05 compared with control.

表2 結腸SMP膽堿能神經(jīng)元的變化Table 2 Changes of cholinergic neurons in colonic n=7)

*P<0.05 compared with control.

表3 結腸SMP VIP能神經(jīng)元的變化Table 3 Changes of VIPergic neurons in colonic n=7)

*P<0.05 compared with control.

表4 結腸SMP氮能神經(jīng)元的變化Table 4 Changes of nitrergic neurons in colonic n=7)

*P<0.05 compared with control.

乙酰膽堿(Ach)是SMP神經(jīng)元釋放的主要興奮性遞質。ChAT是膽堿能神經(jīng)元特異性標志[6]。不同類型膽堿能神經(jīng)元釋放Ach發(fā)生變化，均能夠影響腸道的分泌反射。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS-C模型大鼠結腸SMP中膽堿能神經(jīng)元比例以及活化比例均顯著降低，提示其對結腸分泌功能的促進作用可能下降，結腸黏膜分泌減少。

VIP是SMP分泌運動神經(jīng)元釋放的主要興奮性遞質[7- 8]，促進上皮的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)，IBS-C模型大鼠結腸SMP中，VIP能神經(jīng)元數(shù)量和比例顯著降低，并且其活化比例明顯降低，提示SMP神經(jīng)元釋放VIP減少，相應的黏膜上皮分泌功能下降，促進便秘的發(fā)生。

NO是ENS氮能神經(jīng)元釋放的最主要的抑制性遞質，NO含量在不同亞型IBS患者中的變化存在差異[9- 10]，IBS-D患者結腸黏膜NO含量顯著減少，而IBS-C患者NO含量明顯增高；黏膜NO含量與乙狀結腸、直腸的運動指數(shù)呈負相關。氮能神經(jīng)元在ENS肌間神經(jīng)叢中密集分布，僅少量分布于SMP；NOS是這類神經(jīng)元標志物。本研究發(fā)現(xiàn)IBS-C大鼠結腸SMP中NOS-IR陽性神經(jīng)元總數(shù)和比例均顯著增多，并且活化的程度增高；推測該變化可能導致分泌運動神經(jīng)元的興奮性受抑制，黏膜分泌功能減弱，相應出現(xiàn)糞便顆粒數(shù)和含水量下降；并且分泌運動神經(jīng)元興奮性受抑制還可導致黏膜下小血管的舒張作用減弱，而后者與黏膜分泌反射調控密切相關[11]。

綜上所述，IBS-C模型大鼠的結腸SMP興奮性分泌運動神經(jīng)元活化減少，抑制性神經(jīng)元活化增多，可能參與結腸黏膜分泌調節(jié)的異常，提示腸神經(jīng)系統(tǒng)SMP的變化可能在IBS-C的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。