陜西鳳翔秦公一號(hào)大墓車馬坑馬骨遺骸古DNA研究*

蔡大偉 朱司祺 胡松梅 田亞岐 孫洋 陳曦 周慧

（1.吉林大學(xué)邊疆考古研究中心；2.陜西省考古研究院；3.山東省石刻藝術(shù)博物館；4.吉林市博物館）

馬的馴化是歐亞草原游牧文明興起、繁榮的關(guān)鍵，深刻地影響著人類社會(huì)的發(fā)展進(jìn)程。在中國，家馬和馬車是商代晚期突然大量出現(xiàn)的，然而晚商之前有關(guān)馬的考古材料非常少。早期馴化階段的缺失和商代晚期家馬的“突然”出現(xiàn)，使中國家馬的起源引起了廣泛的爭論。一些學(xué)者認(rèn)為中國家馬是從中亞草原地帶傳入的，甘青地區(qū)和北方草原地帶可能是其進(jìn)入中國的主要通道[1,2]。也有學(xué)者認(rèn)為中國家馬是由本土的普氏野馬馴化而來[3,4]，在馴化時(shí)間上存在“新石器時(shí)代中期”[5]、“龍山時(shí)期”[6]、“夏末商初”[7]等看法。近年來的古DNA研究顯示中國古代馬既有本地馴化的因素，也受到外來家馬基因流的影響，歐亞草原很可能是家馬及馴化技術(shù)由西向東傳播進(jìn)入中國的一個(gè)主要路線。但是，由于缺乏西北地區(qū)家馬的DNA數(shù)據(jù)，家馬在中國的擴(kuò)散路線尚不清楚。

秦公一號(hào)大墓位于鳳翔縣城南雍水河北岸平地上，于1976～1986年先后發(fā)掘十年。大墓規(guī)模龐大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過先秦諸侯的墓葬，是中國發(fā)掘的最大的先秦墓葬。根據(jù)墓葬中出土的石磬上的銘文，考古學(xué)家推斷秦公一號(hào)大墓的墓主人為秦景公（？～前537年）。墓葬展

示了春秋晚期秦國的強(qiáng)大，隨葬物品豐富，墓葬規(guī)格很高，出土的黃腸題湊是周秦時(shí)代規(guī)格最高的葬具，并有183人的人殉[8]。2007年，陜西省考古研究院人員在秦公一號(hào)大墓西南側(cè)發(fā)現(xiàn)車馬坑，坑為東西向長方形豎穴，東西長17.5、南北寬3.1米，坑內(nèi)底部自東向西依次擺設(shè)了5組車馬，考古人員根據(jù)其有車無輪的情況，推斷其為正式陪葬坑之外的一個(gè)祭祀坑。這批車馬坑的出土，一方面對(duì)于我們了解先秦車制、車馬殉葬制度及祭祀制度諸多問題具有重要意義；另一方面，殉葬的馬匹對(duì)我們探索中國家馬的起源具有重要意義。本研究希望利用古DNA技術(shù)重建古馬的遺傳結(jié)構(gòu)，通過對(duì)比分析，揭示陜西地區(qū)古代馬與其他地區(qū)古代馬之間的遺傳關(guān)系，為研究家馬在中國的擴(kuò)散提供有價(jià)值的線索。

表一 秦公一號(hào)大墓取樣及樣本保存情況

表二 本研究所用擴(kuò)增引物

一、材料和方法

1. 樣本來源及保存狀況

本研究樣品來自2007年7月至11月發(fā)掘的陜西鳳翔秦公一號(hào)大墓1號(hào)祭祀坑?？拥讝|西向依次擺設(shè)5組車（自東向西依次編號(hào)1～5號(hào)車），每組車前分別有挽馬工具。我們對(duì)每匹馬的門齒進(jìn)行了采樣，進(jìn)行古DNA分析（表一）。

2. 古代樣本處理

首先用毛刷除去樣本表面污垢，接著用電動(dòng)打磨工具去除表層1～2 mm，然后用10%次氯酸溶液浸泡古代材料5～10min，在紫外線照射下晾干，隨后將樣品放入液氮冷凍粉碎 機(jī) FREEZER/MILL6750（SPEXP CetriPrep，USA）之中，液氮冷卻，打磨成粉，－20℃冷凍保存。

3. 古DNA提取、擴(kuò)增和測序

古DNA提取參照楊東亞等人的文獻(xiàn)進(jìn)行[9]。

PCR擴(kuò)增：依據(jù)馬的參考序列X79547[10]設(shè)計(jì)兩對(duì)套疊引物，擴(kuò)增349bp (核苷酸位置15424—15772) 線粒體DNA片段（表二）。擴(kuò) 增 反 應(yīng) 均 在 Mastercycler? personal 熱 循 環(huán)儀 (Eppendorf，Germany） 上 進(jìn) 行。50 μL反應(yīng)體系中含 2.5 mM Mg2+，1X Buffer，0.2 mMdNTPs， 0.5 μM 正反引物，1U Taq 酶，2 μL模版。程序如下：95℃ 5 min，92℃ 1 min變性，50-55℃ 退火 1 min，72℃ 延伸 1 min，36個(gè)循環(huán)后，72℃ 延伸10 min，4℃保持。

測序：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2% 瓊脂糖(Biowest，German)凝膠電泳檢測，使用QIAEX?Ⅱ GEL Extraction Kit 凝膠回收試劑盒(QIAGen，Germany) 純化PCR產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用ABI PRISM? 310全 自 動(dòng) 遺 傳 分 析 儀（Applied Biosystems，USA）通過Dyeprimer試劑盒進(jìn)行正反雙向直接測序。

4. 污染的防止

所有實(shí)驗(yàn)都是在專門的古DNA實(shí)驗(yàn)室中完成。PCR前和PCR后實(shí)驗(yàn)操作分別在兩個(gè)相距很遠(yuǎn)的、獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)樓中進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)室都要經(jīng)過紫外線長時(shí)間照射，對(duì)超凈臺(tái)進(jìn)行紫外線照射和通風(fēng)至少30min，并隨時(shí)用DNA 去除劑擦拭。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員穿著雙層防護(hù)服，戴一次性帽子、口罩、雙層手套，使用高壓滅菌的一次性實(shí)驗(yàn)耗材。通過設(shè)置DNA抽提和PCR擴(kuò)增空白對(duì)照，來判斷實(shí)驗(yàn)步驟和實(shí)驗(yàn)試劑是否有污染。最后，對(duì)于同一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本，不同實(shí)驗(yàn)人員要進(jìn)行多次DNA抽提和PCR擴(kuò)增重復(fù)操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二、結(jié)果和分析

1. 秦公一號(hào)墓古代馬DNA序列和世系歸屬

在秦公一號(hào)大墓出土的10個(gè)樣本中，F(xiàn)X3、FX8、FX10未能成功提取DNA，其余7個(gè)樣本均成功提取DNA并獲得可靠的古DNA序列。其中FX4、FX5 成功獲得349bp序列，F(xiàn)X1、FX2、FX6、FX7、FX9成功獲得201bp序列（表三）。與參考序列X79547相比共檢測出22個(gè)變異位點(diǎn)，所有堿基變異位點(diǎn)全部是轉(zhuǎn)換，無顛換，無插入發(fā)生（表四）。

表三 秦公一號(hào)墓古代馬實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表四 秦公一號(hào)墓古代馬DNA序列和世系歸屬

線粒體DNA被廣泛應(yīng)用于家馬的起源研究中, Jansen[11]等將現(xiàn)代家馬劃分為7個(gè)線粒體DNA世系A(chǔ)—G，其中幾個(gè)較大的世系可以進(jìn)一步劃分為多個(gè)亞組，世系A(chǔ)共有7個(gè)亞組A1—A7，世系B和C各有2個(gè)亞組B1—B2和C1—C2，世系F和D各有3個(gè)亞組F1—F3和D1—D3。根據(jù)變異位點(diǎn)分析，F(xiàn)X1和FX2分別屬于D1和D2亞組，F(xiàn)X4屬于A1亞組，F(xiàn)X5屬于B2亞組（表四）。由于缺乏后段的信息，推測FX6、FX7、FX9屬于A世系，具體的亞組信息需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來補(bǔ)全序列驗(yàn)證。

2. 秦公一號(hào)大墓古代馬與現(xiàn)代馬的遺傳關(guān)系

為了追蹤秦公一號(hào)大墓古代馬與現(xiàn)代家馬的遺傳關(guān)系，我們利用BLAST程序在美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI) 的DNA序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）中進(jìn)行共享序列搜索，即搜尋與這些古代序列完全匹配的共享序列。FX1、FX4、FX5、FX6、FX9在GenBank中搜索到了完全相同的共享序列，而FX2和FX7沒有搜索到完全一致的共享序列。圖一顯示了古代馬的共享序列在世界各地的分布情況，F(xiàn)X1主要分布在歐洲，尤其是伊比利亞半島，在東亞等地有少量分布。FX4主要分布在西南西伯利亞、中亞和東亞。FX5所共享的單倍型數(shù)量較少，主要分布在中東、中亞、北亞和東亞。FX6在歐亞大陸分布最為廣泛，在歐洲、阿拉伯半島、中亞、北亞和東亞均有分布，表明FX6是現(xiàn)代家馬的主要基因型。FX9主要分布在中亞、北亞和東亞地區(qū)。

3. 秦公一號(hào)大墓古代馬序列在中國古代遺址中的分布情況

為了探索秦公一號(hào)墓古代馬與其他地區(qū)古代馬的關(guān)系，我們調(diào)查了秦公一號(hào)墓古代馬在中國13個(gè)古代遺址[12～17]中的分布情況（圖二、表五）?；诳脊虐l(fā)掘資料分析，這些遺址的年代不盡相同。首先，大山前遺址的時(shí)代最早，屬于中國北方青銅時(shí)代早期夏家店下層文化（年代距今2000～1500 BC）。其次是西周時(shí)期（年代距今1046～771 BC）的陜西少陵原遺址和棗樹溝腦遺址，以及青海卡約文化（年代距今1000～800 BC）豐臺(tái)遺址。最后，所有其他的遺址都屬于春秋戰(zhàn)國時(shí)期，年代距今500 BC。FX1、FX2、FX7在其他古代遺址中均無發(fā)現(xiàn)，為秦公一號(hào)大墓古代馬所獨(dú)有的單倍型。FX4、FX5、FX6和FX9在其他古代遺址中有分布，其中FX6序列分布最廣泛，在豐臺(tái)遺址、忻州窯子墓地、小雙古城墓地以及毛園民宅均有分布；其次是FX4和FX9在棗樹溝腦、忻州窯子墓地、新店子墓地均有發(fā)現(xiàn)；而FX5則僅出現(xiàn)在棗樹溝腦遺址和于家莊墓地中。從時(shí)間上看，秦公一號(hào)大墓部分古代馬在西周時(shí)期就已經(jīng)在西北地區(qū)，并在春秋戰(zhàn)國之際出現(xiàn)在寧夏、內(nèi)蒙古地區(qū)，這一結(jié)果一方面反映了古代馬的基因連續(xù)性，另一方面反映了不同地區(qū)的馬群存在廣泛的交流，可能與地區(qū)間的人群文化貿(mào)易交流活動(dòng)有關(guān)。

圖一 秦公一號(hào)大墓樣本共享序列在世界分布圖

圖二 本研究涉及的考古遺址的地理位置分布圖

表五 秦公一號(hào)墓古代馬在13個(gè)古代遺址中的分布

三、討論

1. 秦公一號(hào)大墓古代馬的母系來源

考古和基因證據(jù)表明，家馬是在距今5500年前在中亞草原被馴化的[18,19]，但是家馬和馬車從商代晚期才開始在中國大量出現(xiàn)，而且從馬車的構(gòu)造看，中國馬車與西方馬車在形制上基本相同，很可能與馴化的家馬同時(shí)從西方傳入[20]，連接?xùn)|西方的歐亞草原通道和經(jīng)由新疆及河西走廊的綠洲之路是家馬進(jìn)入中國兩條主要傳播路線。在所獲得的7個(gè)古代馬DNA序列中，F(xiàn)X1屬于D1亞組，而FX2屬于D2亞組。世系D1亞組的建立者最早出現(xiàn)在南西伯利亞阿勒泰地區(qū)（900BC）[15]，稍晚的時(shí)候在內(nèi)蒙古涼城縣忻州窯子墓地（500BC）[14]和哈薩克斯坦Berel遺址（300BC）[21]出現(xiàn)。世系D2亞組的建立者最早出現(xiàn)在青銅時(shí)代中歐摩爾多瓦M(jìn)iciurin遺址（1500～1000 BC），在鐵器時(shí)代出現(xiàn)在圖瓦（619～609 BC）、 蒙古（400～300 BC）[15]。FX5屬于世系B2亞組，該組的建立者最早也是出現(xiàn)在Miciurin遺址，稍晚的時(shí)候在寧夏于家莊墓地以及哈薩克斯坦Berel遺址也曾出現(xiàn)。從D1、D2和B2的出現(xiàn)時(shí)間和地點(diǎn)看，有一個(gè)明顯的由西向東傳播的趨勢，考慮到中亞草原是家馬的起源中心，我們的研究表明秦公一號(hào)大墓部分古代馬的母系來自歐亞大陸西部，西北地區(qū)是家馬進(jìn)入中國的一條重要通道。

2. 秦與北方游牧民族的交流

春秋時(shí)期，秦與戎狄之間存在廣泛的貿(mào)易交流活動(dòng)，例如在關(guān)中地區(qū)可以見到狄人遺存中非常有代表性的器物——虎飾牌、虎形銅器、花格劍與銅釜[22]。田亞岐指出東周時(shí)期關(guān)中秦墓也受到了戎狄文化因素的影響，體現(xiàn)了秦與戎狄文化的相互影響和交融[23]。出于戰(zhàn)爭的需要，馬成為最重要的家畜。秦國的地理位置使其可以很容易的從鄰近的游牧民族那里引進(jìn)優(yōu)良的馬匹。秦人與北方游牧人群的關(guān)系可以從其飼養(yǎng)的馬匹可窺一斑。FX4、FX6和FX9在春秋戰(zhàn)國時(shí)期出現(xiàn)在內(nèi)蒙古忻州窯子、小雙古城、新店墓地。這三個(gè)墓地都位于北方農(nóng)牧交錯(cuò)帶上，普遍流行用牛、馬、羊殉牲，呈現(xiàn)典型的游牧人群特征。古代馬FX5出現(xiàn)在寧夏于家莊墓地，該墓地也是游牧人群墓地。無論是與鳳翔臨近的寧夏地區(qū)，還是遙遠(yuǎn)的內(nèi)蒙古地區(qū)都飼養(yǎng)相同的馬，表明秦人與北方游牧人群存在廣泛的貿(mào)易交流活動(dòng)，同時(shí)也反映出古人在遺傳育種上強(qiáng)烈的選擇性。

圖三 中國古代馬序列在土庫曼阿哈爾捷金馬中的分布圖

3. 汗血寶馬引入時(shí)間的探討

張騫出使西域時(shí)，在大宛國（今費(fèi)爾干納盆地）發(fā)現(xiàn)了汗血馬，歸來時(shí)說：“西域多善馬，馬汗血，其先天馬子也”。目前的科學(xué)研究表明，傳說中的“汗血寶馬”，實(shí)際上就是土庫曼斯坦特產(chǎn)的“阿哈爾捷金馬（Turkoman Akhal-teke）”。 許多世界著名的馬種如純血馬、阿拉伯馬、特雷克納馬都有阿哈爾捷金馬的血統(tǒng)。汗血馬作為一種珍貴、優(yōu)良的馬種，必定是古人重要的貿(mào)易對(duì)象，而秦國優(yōu)越的地理位置使其很容易與游牧人群進(jìn)行馬匹的貿(mào)易交流，作為強(qiáng)大的秦國君主的陪葬車馬坑，一定會(huì)選擇最好的良馬殉葬，因此能否在秦公一號(hào)大墓中發(fā)現(xiàn)汗血馬的蹤跡是我們關(guān)注的焦點(diǎn)問題。在共享序列搜索中，我們發(fā)現(xiàn)FX5的共享序列較少，主要是中亞馬、阿拉伯馬、北亞蒙古馬和中國馬。值得注意的是，F(xiàn)X5與兩個(gè)現(xiàn)代土庫曼阿哈爾捷金馬序列（DQ327958、EU093049）完全相同。FX4的共享序列主要集中在西南西伯利亞和中亞，其中也兩個(gè)阿哈爾捷金馬序列（DQ327950、EU093051）這種情況引起了我們的注意，為了揭示中國古代馬與阿哈爾捷金馬的母系遺傳關(guān)系，我們選擇了現(xiàn)代土庫曼阿哈爾捷金馬的序列DQ327950–DQ327967，GQ119632-GQ119636，EU093045-EU093063作為對(duì)比，進(jìn)行了中介網(wǎng)絡(luò)分析（圖三）。中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示西周時(shí)期陜西棗樹溝腦和青海豐臺(tái)遺址，以及春秋戰(zhàn)國時(shí)期寧夏于家莊、內(nèi)蒙古新店子、忻州窯子、小雙古城、井溝子的古代馬都與土庫曼阿哈爾捷金馬有關(guān)系，這表明汗血馬的基因型很早就已經(jīng)出現(xiàn)在西北地區(qū)，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于漢代張騫出使西域的時(shí)間，這進(jìn)一步驗(yàn)證了早在漢代之前，我國與西方就已經(jīng)有了經(jīng)濟(jì)文化交流。

值得注意的是，中國古代馬的基因型也出現(xiàn)在其他品種的家馬之中，盡管這可能與古代先民培育馬種的過程中選擇良馬有關(guān)，但中國古代馬與汗血馬的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究，今后的古DNA全基因組研究有望為我們更清晰地揭示出中國古代馬與汗血馬的關(guān)系。

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