橡膠樹可可毛色二孢葉斑病菌生物學特性及藥劑篩選試驗

戴利銘，劉一賢，施玉萍，李嵐嵐，張 璇 ，蔡志英

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南 景洪 666100；2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學院，云南 景洪 666100）

天然橡膠為四大工業(yè)原料之一，在國防和經(jīng)濟建設(shè)中占有關(guān)鍵地位［1］。目前我國天然橡膠生產(chǎn)規(guī)模居世界第4位，生產(chǎn)量居世界第6位，而消耗量和進口量卻居世界第1位［2］。海南、云南、廣東為我國橡膠樹主要種植區(qū)，由于種植區(qū)氣候條件溫暖濕潤，有害微生物繁殖和蔓延致使橡膠樹的根莖葉經(jīng)常遭受多種病蟲害的威脅，從而嚴重制約橡膠產(chǎn)量［3］。葉斑病是橡膠樹的毀滅性病害之一，也是限制我國橡膠單產(chǎn)提高的關(guān)鍵因素之一［4］。2016年，本課題組在海南、云南、廣東的橡膠種植區(qū)資源圃中進行病害調(diào)查時發(fā)現(xiàn)一種新的橡膠葉受害癥狀，受害葉初期葉緣或葉尖呈現(xiàn)黃色小點，隨后病斑逐漸擴展成近圓形至不規(guī)則形、水浸狀的灰褐色至褐色病斑，數(shù)個病斑最終匯合成大的斑塊，葉緣向上卷曲［5］；該病為害幼莖和葉柄，形成黑褐色的條斑，在高溫多雨天氣情況下引起植株頂部嫩葉枯死、凋落。經(jīng)形態(tài)和分子生物學鑒定該病病原菌為可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae），為我國橡膠樹葉的一種新病害［5］。

目前報道由可可毛色二孢引起的植物病害較為常見，如可可毛色二孢引起的甘薯爪哇黑腐?。?］、高良姜葉枯病［7］、白木香枝枯?。?］、廣西桉樹潰瘍?。?］、桉樹枝枯?。?0］、毛葡萄穗軸褐腐?。?1］、蓮霧黑腐病［12］、黑木耳黑皮病［13］等。但迄今為止，國內(nèi)還沒有可可毛色二孢引起的橡膠樹葉斑病的相關(guān)研究報道，對可可毛色二孢病原菌生物學特性及防控藥劑的研究還處于空白。

隨著橡膠樹種植面積迅速擴大、種植品種趨于單一化，可可毛色二孢引起的葉斑病或許會爆發(fā)成災。目前關(guān)于橡膠樹主要病害的控制技術(shù)主要是藥劑防治［14］，本研究通過不同藥劑對可可毛色二孢進行室內(nèi)毒力測定，為可可毛色二孢引起橡膠樹葉斑病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株由云南省熱帶作物科學研究所分離、鑒定、保存。

供試殺菌劑：咪鮮胺450 g/L水乳劑（江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司）、丙環(huán)唑250 g/L乳油（先正達蘇州作物保護有限公司）、代森錳鋅80%可濕性粉劑 （北京燕華永樂生物科技股份有限公司）、百菌清75%可濕性粉劑（世科姆化學貿(mào)易有限公司）、甲基硫菌靈70%可濕性粉劑 （山東海迅生物科技有限公司）、三唑酮25%可濕性粉劑（江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）、異菌脲50%可濕性粉劑（江門方大光明農(nóng)化新會有限公司）、苯醚甲環(huán)唑10%水分散粒劑（先正達蘇州作物保護有限公司）、多菌靈50%可濕性粉劑（江蘇藍豐生物化工股份有限公司）、嘧菌酯 250 g/L懸浮劑 （先正達南通作物保護有限公司）。

供試培養(yǎng)基：（1）PDA培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g，馬鈴薯20 g，瓊脂1.8 g，dd H2O定容至100 mL，pH自然；（2）查氏培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀0.1 g，硝酸鈉0.2 g，硫酸鎂0.05 g，硫酸鐵0.001 g，氯化鉀0.05 g，蔗糖3 g，瓊脂1.5～2 g，無菌水定容至100 mL。培養(yǎng)基均于121℃滅菌20 min后備用。

1.2 病原菌生物學特性研究

1.2.1 溫度對病原菌生長的影響 用打孔器在PDA平板上培養(yǎng)2 d的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，分別置于 5、10、15、20、25、28、30、35℃ 下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 pH對病原菌生長的影響 分別用1 mol/L的HCl和NaOH溶液調(diào)節(jié)冷卻至60℃左右的PDA培養(yǎng)基，制成pH分別為3、4、5、6、7、8、9的PDA平板，用打孔器打取直徑5 mm菌餅接種于不同的pH平板。

1.2.3 病原菌菌絲的致死溫度 將病原菌菌株接種到PDA平板上培養(yǎng)2 d后，用打孔器在病原菌菌落邊緣打取直徑5 mm菌餅，置于放有2 mL無菌水的玻璃試管（已滅菌），分別于40、45、50、51、52、53、54、55、60℃恒溫水浴鍋中處理10 min，迅速冷卻，無菌條件下將菌餅取出接種于PDA平板中央，以室溫中放置的試管作為對照，逐日觀測菌絲生長情況。

1.2.4 碳源對病原菌生長的影響 以蔗糖、木糖、乳糖、麥芽糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、淀粉、果糖、甘油11種碳源分別代替Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖。

1.2.5 氮源對病原菌生長的影響 以色氨酸、牛肉浸膏、酵母浸膏、精氨酸、尿素、硫酸銨、酪氨酸、丙氨酸、蛋白胨、胱氨酸、甘氨酸11種氮源分別代替Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，配制不同氮源培養(yǎng)基。

1.2.6 光照對病原菌生長的影響 設(shè)置24 h黑暗、24 h光照、9 h黑暗/9 h光照3種光照條件，將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，觀察菌落生長情況。

上述處理均重復3次，培養(yǎng)36 h后，用十字交叉法測量菌落直徑。

1.3 殺菌劑對病原菌的室內(nèi)毒力測定

將殺菌劑用無菌水配制成濃度不同的平板（表1），以不含藥劑的平板為對照。打取病原菌菌餅接種至殺菌劑平板中央，每個濃度接3個平板，重復3次。采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落直徑的平均值及抑制率［15-16］：

表1 各供試殺菌劑的有效濃度

抑制率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-0.5 cm）×100

毒力回歸方程以濃度的對數(shù)值（x）和平均抑菌率的機率值（y）表示，比較供試9種殺菌劑對供試菌株的毒力大?。?6］。根據(jù)求得的毒力回歸方程，分析病原菌對殺菌劑的敏感性［16-17］。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌生物學特性研究

2.1.1 溫度對病原菌生長的影響 病原菌菌絲體生長特性測定結(jié)果（圖1）表明，可可毛色二孢菌絲體在15～40℃之間都能生長，25～35℃為其適宜的生長溫度范圍，培養(yǎng)36 h后菌落直徑在56.36～73.23 mm之間。從圖1可以看出，可可毛色二孢最適生長溫度為30℃，培養(yǎng)36 h后菌落直徑達到73.23 mm。高于35℃時菌絲體比較敏感，低于15℃或高于40℃時菌絲體生長受到抑制或無法正常生長。

圖1 溫度對病原菌菌絲體生長的影響

2.1.2 pH對病原菌生長的影響 在供試的所有pH值（3～9）下可可毛色二孢菌絲體均能生長，最適宜菌絲體生長的pH為6，培養(yǎng)36 h后菌落直徑達到67.68 mm。由圖2可知，該菌生長的pH較廣，在酸性、中性、弱堿性條件下生長都較為良好。

圖2 pH對病原菌菌絲體生長的影響

2.1.3 病原菌菌絲的致死溫度 以在室溫下培養(yǎng)的菌絲體作對照，設(shè)置9個溫度對可可毛色二孢菌絲體進行處理，在40、45、50、51、52℃處理10 min后仍然能在PDA平板上正常生長，但是在53℃及以上溫度處理10 min后不能生長。由此表明，53℃10 min為可可毛色二孢菌絲體的致死溫度。

2.1.4 碳源對病原菌生長的影響 可可毛色二孢在供試的11種碳源上均可生長，但對不同碳源利用程度存在差異（圖3），對葡萄糖和果糖利用率最高，菌絲生長速度最快，培養(yǎng)36 h后菌落直徑分別達76.34 mm和68.42 mm，在含有半乳糖和蔗糖的查氏培養(yǎng)基上生長狀況良好；在含麥芽糖、木糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、乳糖的查氏培養(yǎng)基上生長狀況一般，菌落直徑在43.20～52.52 mm。在不含任何碳源的查氏培養(yǎng)基上生長時，菌絲體生長快但稀薄。

圖3 碳源對病原菌菌絲體生長的影響

2.1.5 氮源對病原菌生長的影響 在含有12種不同氮源的查氏培養(yǎng)基上，可可毛色二孢菌生長狀況差異較大，在含酵母浸膏、牛肉浸膏的查氏培養(yǎng)基上生長較快且菌絲生長旺盛，培養(yǎng)36 h后菌落直徑分別達70.25 mm和72.30 mm。該菌在不含任何氮源的培養(yǎng)基上生長快但生長不旺盛，而在含有尿素的查氏培養(yǎng)基上生長最慢，在含有丙氨酸的查氏培養(yǎng)基上生長快但菌絲極其稀?。▓D4）。

2.1.6 光照條件對病原菌生長的影響 全光條件下菌絲體生長速率最快，但菌絲稀薄。完全黑暗條件下生長較慢，但是菌絲長得茂盛。菌絲體在光/暗交替條件下生長較全光照條件下慢（圖5）。

2.2 供試殺菌劑對可可毛色二孢的室內(nèi)毒力測定

2.2.1 殺菌劑對可可毛色二孢EC50值的比較分析 由表2可知，對可可毛色二孢毒力作用最強的是多菌靈，其EC50小于0.1 μg/mL；其次為丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲，其 EC50分別為 0.2176、0.2019、0.3566、0.5146 μg/mL；毒力作用一般的為百菌清、咪鮮胺，平均 EC50值分別為 6.003、1.5202 μg/mL；代森錳鋅、嘧菌酯兩種藥劑對供試病原菌的毒力作用較差，其平均EC50值分別為36.1659、75.7705 μg/mL；三唑酮對病原菌的毒力作用最差，平均EC50值為102.0939 μg/mL。由此表明，10種供試殺菌劑對可可毛色二孢的毒力存在明顯差異，其中多菌靈的抑菌效果最好，其次為甲基硫菌靈。

2.2.2 殺菌劑對可可毛色二孢EC75值的比較分析 由表2可知，10種供試藥劑可分為4類，第1類是多菌靈，抑菌效果最好，平均EC75值小于0.1 μg/mL；第2類是異菌脲、甲基硫菌靈，平均EC75小于1 μg/mL，分別為0.9627、0.31703 μg/mL；第3類是丙環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、咪鮮胺、代森錳鋅，平均EC75值在1.5933～162.7796 μg/mL之間，抑菌效果較差；第4類為嘧菌酯、三唑酮，平均EC75值為516～607.4353 μg/mL，說明該藥劑對該病菌基本沒有抑制效果。

表2 供試殺菌劑對可可毛色二孢的毒力測定結(jié)果

2.2.3 可可毛色二孢對殺菌劑的敏感性比較分析 毒力回歸曲線的斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性成正比。從表2毒力回歸方程中可以看出，可可毛色二孢對殺菌劑的敏感性斜率范圍在0.3496～4.0790之間，其中多菌靈對可可毛色二孢的斜率值最大，為4.0790；其次為甲基硫菌靈，斜率組為3.4432；而百菌清和咪鮮胺的斜率值最小，分別為0.4706和0.3496。表明在供試的殺菌劑中，可可毛色二孢對多菌靈最敏感，其次為甲基硫菌靈，而對百菌清和咪鮮胺最不敏感。

3 結(jié)論與討論

熱帶、亞熱帶地區(qū)橡膠樹資源豐富，而高溫高濕的氣候也使微生物快速生長繁殖，導致橡膠樹的根、莖、葉部病害發(fā)生嚴重。本課題組從廣東、海南和云南省等多個苗圃橡膠葉斑病上分離得到一種橡膠樹新致病菌——可可毛色二孢［5］。為對該病的防治提供理論指導，本課題組對可可毛色二孢的生物學特性進行初步研究，發(fā)現(xiàn)25～35℃適宜該病原菌菌株生長，30℃為最適生長溫度；當溫度高于40℃時或低于15℃，菌絲體的生長受到抑制，這與文新、薛振南等［18-19］報道的肉桂枝枯病菌可可毛色二孢菌相似；可可毛色二孢菌絲體致死溫度是53℃ 10 min，與薛振南等［19］報道的可可毛色二孢相似，說明該菌是一種偏好高溫適生菌；該菌生長的pH范圍與薛振南等［19］報道相同，在pH 3.0～9.0范圍內(nèi)均能生長，以pH 5.0～6.0生長最好；可可毛色二孢對碳源和氮源要求不嚴格，對各種碳源和氮源的利用率都很高；其中碳源以葡萄糖利用率最高，這與史國英等［20］報道的毛葡萄穗軸褐腐病可可毛色二孢菌相似，而與車建美等［21］報道的蓮霧黑腐病病原菌可可毛色二孢菌不同（最佳碳源為甘露醇）；氮源以牛肉浸膏利用率最高，這與董章勇等［22］報道的沙田柚果腐病可可毛色二孢不同（最佳氮源為甘氨酸），但這兩個來源的可可毛色二孢都無法利用尿素。研究報道的可可毛色二孢特性與本試驗所測部分結(jié)果一致、部分結(jié)果不同，這可能與不同地區(qū)所分離到的菌株的生物學特性、抗逆性、致病性以及菌落形態(tài)等方面均存在差異有關(guān)。

目前報道由可可毛色二孢引起的植物病害較為常見，但與其相應的毒力實驗國內(nèi)相關(guān)報道較少。鄒東霞等報道8種殺菌劑對桉樹枝枯病病原菌室內(nèi)毒力測定，發(fā)現(xiàn)對可可毛色二孢抑菌效果最好的是25%咪鮮胺，EC50值為0.03 mg/L［23］；宋雅琴等為篩選適合防治葡萄潰瘍病的殺菌劑，采用菌絲生長速率法測定了目前生產(chǎn)中常用的25種殺菌劑對葡萄潰瘍病菌毛色二孢的抑制效果，發(fā)現(xiàn)丙森鋅可濕性粉劑、多菌靈可濕性粉劑對毛色二胞菌絲生長的抑制率可達100%［24］。唐利華等報道10種殺菌劑對廣西杧果流膠病菌的室內(nèi)毒力測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈對杧果流膠病3種主要病原菌可可毛色二孢、七葉樹殼梭孢和小新殼梭孢的抑制效果最好［25］。本研究以10種供試藥劑對可可毛色二孢菌絲體生長的EC50值和毒力回歸方程斜率進行分析，發(fā)現(xiàn)多菌靈、丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑、異菌脲這5種藥劑對橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的EC50平均值在0.0675～0.5146 μg/m之間，說明這5種藥劑對橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的抑菌效果較好，其中多菌靈的EC50值最小，且在所有藥劑實驗中對病原菌最敏感，這與唐利華等和宋雅琴等的報道［24-25］相似。但對橡膠樹褐根病的抑制效果，多菌靈抑制效果最差［26］。多菌靈是一種具有保護和治療功能的苯并咪唑類殺菌劑，常用于防治杧果炭疽病和蒂腐?。?7-28］，其作用機理是阻止β-微管蛋白與α-微管蛋白組裝成微管或使已組裝的微管解聚，導致紡錘體不能形成，進而阻止真菌細胞的有絲分裂，但文獻報道長期大量使用藥劑多菌靈容易產(chǎn)生抗藥性［29-30］。僅從毒力測定結(jié)果來看，多菌靈是用來防治可可毛色二孢葉斑病最好的藥劑，丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑等可作為交替使用的農(nóng)藥品種。由于該實驗藥劑篩選是在室內(nèi)完成，對橡膠樹可可毛色二孢葉斑病的田間實際防治效果還需做進一步的田間藥效實驗，且還需要考慮各種殺菌劑的成本，對植物和環(huán)境的影響等方面進行綜合比較，以實現(xiàn)經(jīng)濟合理地使用殺菌劑［31］。

本實驗采用實驗室常規(guī)方法研究橡膠樹可可毛色二孢葉斑病菌的生物學特性，研究發(fā)現(xiàn)該菌生長適應性極強，最適生長溫度為30℃；最適生長pH為6；致死溫度為53℃處理10 min，對碳源和氮源要求不嚴格；采用菌絲生長速率法測定了10種殺菌劑對該病原菌的室內(nèi)毒力作用，發(fā)現(xiàn)對可可毛色二孢毒力作用最強、最敏感的藥劑為多菌靈。