康寧霉素對臭椿苗期致病菌的離體抑菌活性

柳婷婷 ，劉南南 ，王桂清

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059；2.聊城市農(nóng)業(yè)委員會，山東 聊城 252000）

木霉菌（Trichodermaspp．）是自然界廣泛分布的一種真菌，屬半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科木霉屬，廣泛存在于土壤環(huán)境中，在植物根基土壤、種子、葉圍和球莖等生態(tài)環(huán)境中也大量存在［1］，目前其對18個屬29個種以上的病原真菌有拮抗作用，具有較高的生防價值［2］，在農(nóng)業(yè)和園林生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用?？祵幟顾兀═richokonins，TKS）是長枝木霉的一種次級代謝產(chǎn)物，能夠有效抑制革蘭氏陽性細(xì)菌和多種植物病原真菌，具有廣譜殺菌性［3］。臭椿（Ailanthus altissima Swingle）根系發(fā)達(dá)、生長迅速，易繁殖［4］，同時具有抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特點，是理想的行道樹。但臭椿幼苗小葉基部腺齒不發(fā)達(dá)，對病蟲害的防御力低，易受病蟲害侵染，病害發(fā)生嚴(yán)重，甚至大面積死亡，因此解決臭椿苗期病害問題迫在眉睫。臭椿苗期病蟲害主要有銹病、白粉病、炭疽病、腐爛病等［5］，經(jīng)采樣、分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)引起臭椿苗期病害的主要致病菌有腐皮鐮刀菌（Fusarium soiani）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、棒狀擬盤多毛孢菌（Pestalopsis clavispora）和極細(xì)鏈格孢菌（Alernaria tenuissima）4種（另文發(fā)表）。目前關(guān)于生物防治臭椿苗期病害的研究較少，也未見用木霉及其代謝產(chǎn)物防治臭椿病害或誘導(dǎo)促生長作用的報道。因此，自2014年開始聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室對臭椿苗期病害致病菌進(jìn)行分離鑒定及室內(nèi)藥效試驗。本試驗以康寧霉素水溶劑為研究對象，以苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、苦參堿和霜霉立克等藥劑為陽性對照，以臭椿苗期病害的主要致病菌為靶標(biāo)，探究康寧霉素對致病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用，以期明確康寧霉素對真菌的抑菌效果，為其防治臭椿苗期病害提供理論依據(jù)，并為其作為生防制劑在園林樹木生物防治中的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為引起起臭椿苗期病害的4種主要病原菌，分別為木賊鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、棒狀擬盤多毛孢菌和極細(xì)鏈格孢菌，保存于聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院病理研究室。采用PDA培養(yǎng)基于25（±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)7 d，用打孔器制取直徑0.7 cm的菌餅接種備用。

供試藥劑為14.39 mg/mL康寧霉素水溶劑和60%多菌靈可濕性粉劑、20%苯醚甲環(huán)唑微乳劑、0.36%苦參堿可溶性液劑、10.3%霜霉立克乳油4種對照農(nóng)藥。

菌絲生長抑制試驗藥液的配制：用無菌水將康寧霉素、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、苦參堿和霜霉立克分別配制成終濃度為25、50、100、200、400 mg/L，6.25、12.5、25、50、100 mg/L，25、50、100、200、400 mg/L，4、8、16、32、64 mg/L，20、40、80、160、320 mg/L，按濃度由低到高編號為1、2、3、4、5，備用。

孢子萌發(fā)抑制試驗藥液的配制：用無菌水將康寧霉素終濃度配制成17.5、35、70、140、280 mg/L，其他4種農(nóng)藥配制終濃度同菌絲生長抑制試驗藥液濃度。

1.2 生物活性測定

以菌絲生長速率法［6-7］測定康寧霉素和對照藥劑對臭椿幼苗4種致病菌的抑制作用。所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，菌餅直徑0.7 cm，每皿1塊，3次重復(fù)，25（±1）℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落直徑大約在3 cm以上時，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率：

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100

以孢子萌發(fā)法［8］測定康寧霉素和4種其他藥劑對孢子萌發(fā)的抑制作用。以只加無菌水為空白對照，3次重復(fù)，12 h觀察結(jié)果，計算孢子萌發(fā)抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

各藥劑濃度進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換，與對應(yīng)的防效機率值作回歸分析，試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計整理，經(jīng)DPSv7.05統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析及顯著性檢驗，求得相關(guān)系數(shù)、線性回歸方程、各藥劑處理的EC50值及其95%置信限，建立毒力回歸曲線等。

2 結(jié)果與分析

2.1 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制作用

2.1.1 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制作用 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌菌絲生長抑制率如圖1所示?？祵幟顾貙?種致病菌菌絲生長均有抑制作用且隨著藥劑濃度的提高，抑制率增大；相同濃度下，康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌抑制率最高，對木賊鐮刀菌抑制率最低，在400 mg/L時抑制率分別為86.37%、54.36%，前者是后者的1.59倍。以對腐皮鐮刀菌菌絲生長抑制作用為例，康寧霉素抑制作用在一定濃度范圍內(nèi)先隨濃度升高直線上升，達(dá)到編號2濃度（50 mg/L）時出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，增長趨勢趨于平緩。多菌靈抑制作用較強，最高濃度（100 mg/L）時抑制率接近100%，而霜霉立克抑制作用一直較差，在供試濃度下抑制率均低于52%。

2.1.2 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制效果 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌的菌絲生長的抑制效果見表1?？祵幟顾貙Π魻顢M盤多毛孢菌的EC50最小、為32.97 mg/L，對極細(xì)鏈格孢菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌的EC50依次增大，分別為95.66、143.91、297.28 mg/L，說明康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌的菌絲生長抑制效果較為顯著。

圖1 5種藥劑對致病菌菌絲生長的抑制率

以對腐皮鐮刀菌菌絲生長抑制效果為例，康寧霉素的EC50為143.91 mg/L，是苦參堿的58.26倍、多菌靈的8.94倍、苯醚甲環(huán)唑的2.02倍，即其藥效僅為苦參堿的1.72%、多菌靈的11.19%、苯醚甲環(huán)唑的49.51%，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌菌絲生長的抑制作用弱于多菌靈、苦參堿和苯醚甲環(huán)唑；康寧霉素的EC50是霜霉立克的0.39倍，即其藥效為霜霉立克的2.56倍，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌菌絲生長的抑制作用優(yōu)于霜霉立克。

2.2 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.2.1 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制作用 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌孢子萌發(fā)抑制率如圖2所示?？祵幟顾貙?種致病菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，對棒狀擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)抑制率最高，在280 mg/L時，對棒狀擬盤多毛孢菌、極細(xì)鏈格孢菌、木賊鐮刀菌、腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制率分別為82.85%、71.33%、67.74%、75.01%。

以對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制效果為例，5種制劑對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，且隨著藥劑濃度的增大，相對抑制率相應(yīng)增大。在試驗濃度條件下，康寧霉素對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制率基本高于對應(yīng)編號濃度下苦參堿和霜霉立克對其抑制率。

2.2.2 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌的孢子萌發(fā)的抑制效果見表2。康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)的EC50最小，為47.99 mg/L，對極細(xì)鏈格孢菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌的EC50依次增大，分別為62.01、76.20、111.19 mg/L，說明康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強。

在對腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制效果上，康寧霉素的EC50為76.20 mg/L，是多菌靈的4.62倍、苦參堿的3.55倍、苯醚甲環(huán)唑的1.04倍、霜霉立克的0.75倍，即其藥效為多菌靈的21.64%、苦參堿的28.20%、苯醚甲環(huán)唑的95.73%、霜霉立克的1.33倍，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用與苯醚甲環(huán)唑相近、優(yōu)于霜霉立克，不及多菌靈和苦參堿。

表1 5種制劑對致病菌菌絲生長的抑制效果

圖2 5種藥劑對致病菌孢子萌發(fā)的抑制率

綜上，康寧霉素對4種致病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用，比較EC50，總體而言康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于對菌絲生長的抑制效果。

3 結(jié)論與討論

康寧霉素對臭椿苗期病害的不同致病真菌抑制效果不同，對棒狀擬盤多毛孢菌的抑制效果最好，最高濃度時對菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制率分別為86.37%、82.85%；對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為32.97、47.99 mg/L，對木賊鐮刀菌抑制效果最差，對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為297.28、111.19 mg/L，說明康寧霉素的抑制作用具有一定的選擇性。

對多數(shù)致病菌來說，以腐皮鐮刀菌為例，康寧霉素對其菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為 143.91、76.20 mg/L，苦參堿為 2.47、21.49 mg/L，多菌靈為16.10、16.49 mg/L，苯醚甲環(huán)唑為71.25、72.95 mg/L，霜霉立克為368.03、101.18 mg/L，康寧霉素的EC50均高于多菌靈和苦參堿，低于霜霉立克，即其抑菌效果低于多菌靈和苦參堿，優(yōu)于霜霉立克，說明康寧霉素對引起臭椿苗期病害的4種致病菌有良好的防治效果。

康寧霉素對多數(shù)致病菌孢子萌發(fā)的EC50均小于對應(yīng)致病菌菌絲生長的EC50，說明康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于其對菌絲生長的抑制效果。該結(jié)論為康寧霉素用于病害流行的防治適期提供了理論基礎(chǔ)。

抗生作用是木霉菌發(fā)揮生物防治作用的重要機制之一，許多木霉在代謝過程中可以產(chǎn)生抑制病原菌的拮抗性化學(xué)物質(zhì)，包括抗生素類和一些酶類，如木霉素、膠霉素、綠木霉素、抗菌肽等。木霉菌產(chǎn)生的次生性代謝產(chǎn)物廣泛應(yīng)用于植物病害防治，在生物及其醫(yī)藥領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用價值［9］，其對很多病原菌有顯著的抑制作用［10］?？祵幟顾厥怯煽祵幠久梗ìF(xiàn)已更名為長枝木霉［11-12］）生防菌SMF2的固體培養(yǎng)物中分離提純獲得的一類Peptaibols抗菌肽，解樹濤等［13］證明康寧霉素對細(xì)菌有抑菌活性，對革蘭氏陽性細(xì)菌的作用大于對革蘭氏陰性細(xì)菌的作用。胡明江等［14］利用長枝木霉SMF2分生孢子制劑進(jìn)行了防治大白菜軟腐病的田間藥效試驗，發(fā)現(xiàn)SMF2分生孢子制劑對大白菜軟腐病具有較好的防治效果，明顯優(yōu)于大面積推廣應(yīng)用的農(nóng)用鏈霉素，且持效期比農(nóng)用鏈霉素長。

表2 5種制劑對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果

解樹濤等［13］證明長枝木霉對真菌有較為廣泛的抑菌譜；常媛等［15］在八寶景天根際土壤中分離得到的一株優(yōu)勢長枝木霉對細(xì)鏈格孢菌等3種土傳病害病原真菌均有較明顯的拮抗作用；張瑾等［16］研究表明長枝木霉菌對蘋果樹腐爛病菌等12種植物病原真菌的生長均有不同程度的抑制作用，其抑菌作用機制主要是競爭作用；陳凱等［17］認(rèn)為長枝木霉的代謝產(chǎn)物Bisorbicillinoids具特異的生物活性，可致辣椒疫霉菌的菌絲畸形，是一種潛在的抗真菌物質(zhì)。

研究證明康寧霉素具有促進(jìn)植物生長及誘導(dǎo)抗性作用，在一定濃度內(nèi)可促進(jìn)皂莢種子的萌發(fā)，有利于國槐幼苗根系的伸長，側(cè)根的形成與生長以及根系系統(tǒng)的穩(wěn)固程度［18］；可以誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，降低煙草花葉病毒的侵染［19］；可通過促生作用和誘導(dǎo)抗性防治大白菜軟腐病［20］。木霉菌株的胞外代謝產(chǎn)物對人、畜為實際無毒，因此可作為綠色生物農(nóng)藥廣泛使用。本課題組將擴大康寧霉素抑菌種類的研究，明確其抑菌譜；同時在長枝木霉及其代謝產(chǎn)物的抑菌機理、對園林植物的促生長作用及誘導(dǎo)抗性等方面繼續(xù)加以深入研究。