激素處理對NtQPT干涉表達煙草種子萌發(fā)及生長影響研究

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(1.貴州大學農業(yè)生物工程研究院/生命科學學院/山地植物資源保護與種質創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室, 貴陽 550025;2.貴州省農業(yè)科學院, 貴陽 550006)

喹啉酸核糖基轉移酶(quinolinic acid phosphoribosyltransferase,QPT)是煙草煙堿(nicotine)合成的限速酶[1-2]。QPT在催化煙堿重要結構1, 2-二氫吡啶(1,2-dihydropyridine)環(huán)形成的過程中,也催化其前體物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)的產生[3],而后者又可作為多種酶的輔酶調節(jié)機體的能量代謝、呼吸鏈電子傳遞、蛋白翻譯后修飾、Ca2+信號通路和基因沉默等生理過程, 并最終影響生物體的生長發(fā)育[4-5]。研究表明,QPT基因沉默不僅可引起轉基因煙草株高的明顯矮化，還會導致部分轉基因植株的葉片數、開花數顯著減少及花粉發(fā)育畸形或不育等現(xiàn)象[6]。植物體中除NAD等初生代謝物會直接影響植物生長發(fā)育外, 次生代謝物(如植物激素)也能調節(jié)植物的發(fā)育和生長[7]。研究表明, 植物體不僅能通過調節(jié)體內ABA(abscisic acid)與GA(gibberellin)的平衡促進或抑制種子萌發(fā)[8],也可通過調節(jié)6-BA(6-benzylaminopurine)和IAA(indoleacetic acid)的比例來調節(jié)植物的生長及品質[9]。本研究以QPT干涉表達的T1代轉基因煙草種子及煙苗為材料, 分析ABA和6-BA處理對轉基因煙草種子萌發(fā)及煙苗生長的影響, 同時分析不同激素引起的轉基因植株理化性質的動態(tài)變化規(guī)律, 為探討QPT基因與ABA或6-BA協(xié)同調控轉基因煙草種子萌發(fā)及煙苗生長提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

普通煙草(NicotianatobacumL.)品種“Xanthi”、T1代超量表達和干涉表達QPT基因煙草種子由貴州大學農業(yè)生物工程研究院保存并提供。6-BA和ABA均購于Sigama Aldrich公司; DNA Marker 購于Takara 生物工程公司;植物DNA提取試劑盒購于Tiangen Biotech(Beijing)Co.,Ltd.,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)購于Suzhou Comin Biotechnology Co.,Ltd.;無水乙醇(分析純)購于Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co.,Ltd.。

1.2 方 法

1.2.1 激素對煙種進行處理

參照秦利軍等[10]的方法略有改動，分別對轉基因及野生型煙草種子的萌發(fā)指標進行統(tǒng)計。挑選飽滿、大小一致的T1代QPT超量表達與干涉表達煙草種子和同批繁殖的野生型煙草的種子依次經70%酒精和2.5% NaClO表面消毒后用無菌水清洗3～5次, 分別置于墊有2層滅菌濾紙且分別含有5 mg/L 6-BA和2 mg/L ABA的9 cm培養(yǎng)皿中進行萌發(fā)處理(約5 mL激素溶液, 以無菌水作為對照), 每皿播種50粒種子, 每處理設置5 個重復。在25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照16 h/黑暗8 h)，種子萌發(fā)以露白計，記錄19 d內煙草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢及發(fā)芽指數等指標。測定指標按下列公司進行計算：

發(fā)芽率(%)=第19天發(fā)芽種子數/供試種子數×100%；

發(fā)芽勢(%)=第10天發(fā)芽種子數/供試種子數×100%；

發(fā)芽指數=∑(Gt/Dt)。

式中，Gt為逐日發(fā)芽數,Dt為相應發(fā)芽天數。

1.2.2 轉基因植株PCR鑒定

剪取T2代煙苗的葉片少量進行GUS化學組織染色, 提取GUS染色陽性植株葉片總DNA用于PCR鑒定。PCR擴增體系(20μL):正反向引物(20μmol/L)各加 1μL,Premix rTaq10μL,DNA 模板1μL,dd H2O 7μL。擴增條件:94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);72 ℃ 延伸7 min,4 ℃保存。特異性檢測引物對FQPT/RQPT序列分別為:F-QPT:5’-CGCACAATCC-CACTATCCTT-3’;R-QPT:5’-TTAGAGCTTTGCCGACACCT-3’。

1.2.3 激素對煙苗進行處理及記錄

將清水萌發(fā)的轉基因與非轉基因煙草種子移栽至育苗盤,待種子長至大十字期時栽種到花盆中,隔3～5 d澆1次水。煙苗生長到拔節(jié)期時分別用6-BA(40 mg/L)和ABA(20 mg/L)進行噴施處理, 每個處理重復3次, 以超量表達QPT煙草和野生型煙草為對照處理。同時, 每實驗組各設置3個以清水噴施的空白對照。種植期間隔一定距離, 定期進行灌根澆水以保證煙株生長對水分的需求。激素噴施處理周期為21 d,每周噴3次激素，每株定量噴施10 mL, 并在實驗起始的7，14，21 d做煙草形態(tài)指標觀察和記錄。

參照國家煙草專賣局2010年發(fā)布的煙草農藝性狀調查測量方法(Investigating and measuring methods of agronomical character of tobacco)YC/T 142-2010標準對激素處理煙草植株的農藝性狀，包括株高、真葉數、莖圍、最大葉長和最大葉寬等指標進行觀察、記錄,每個測定指標測定3次。

1.2.4 激素處理對煙草理化性質影響

選取拔節(jié)期、生長一致的煙草植株進行全株噴施ABA(20 mg/L)和6-BA(40 mg/L)激素溶液, 分別取噴施處理前、噴施后第1、3天煙草植株自上向下第4片真葉進行SOD酶活測定。酶活測定參照Suzhou Comin Biotechnology Co.,Ltd.操作說明以酶標法進行測定, 每組以混樣的方式取樣(即以3個生物學重復樣品做混池),每組重復測定3次,以野生型和超量表達QPT煙草為對照組,清水噴施處理為空白組。

葉綠素含量按鄒琦[11]方法測定, 將取好的葉片放在研缽中, 加入少許石英砂與碳酸鈣粉, 在加入3 mL 96%乙醇磨成勻漿合并提取液并定容至25 mL棕色容量瓶, 避光保存, 在波長665 nm、649 nm、470 nm測定其光密度, 分別按下式進行葉綠素a(chlorophyll a)、葉綠素b(chlorophyll b)、類胡蘿卜素(carotenoid)和葉綠素色素含量計算：

Ca=13.95 D665-6.88 D649；

Cb=24.96 D649-7.32 D665；

Cx=(1 000 D470-2.05 Ca-114.8 Cb)/245；

葉綠素色素含量=提取液體積×色素濃度(C)×稀釋倍數/樣品鮮重(mg/g)。

1.2.5 數據處理

以Microsoft Excel 2011軟件對上述測定的所有原始數據進行平均值和標準誤差計算、作圖, 以SPSS 17.0軟件對各個測定值得顯著性進行分析。

2 結果與分析

2.1 激素處理對轉基因煙種萌發(fā)的影響

從表1結果可知,相比較野生型和超量表達煙草,以5 mg/L 6-BA處理均能顯著提高QPT干涉植株種子的GP、GE和GI。萌發(fā)統(tǒng)計結果(以種子露白計)表明,5 mg/L 6-BA處理第9天時干涉表達QPT煙草種子基本全部發(fā)芽,發(fā)芽率高達91.33%,而超量表達QPT和野生型種子到第11天時才完全發(fā)芽, 發(fā)芽率分別為58.67%和52.67%,且兩者差異不顯著。6-BA對QPTi煙株種子萌發(fā)促進作用相較WT和QPT植株分別提高55.67%和73.40%。與野生型相比,6-BA處理也能促進QPT煙草種子的萌發(fā), 但兩者差異不顯著;以2 mg/L ABA處理能明顯抑制WT和QPT煙草種子的萌發(fā),抑制率分別可達99.33%和94%,相比之下ABA對QPTi種子萌發(fā)抑制率為63.4%,說明QPT基因干涉后轉基因煙草表現(xiàn)出對ABA的低敏感性,種子萌發(fā)相較野生型和超量表達植株影響較小;QPT煙株和WT煙株種子分別在ABA處理后的第14天和第17天才開始萌發(fā),而QPTi煙株種子在激素處理后的第10天就開始萌發(fā)。

表1 種子發(fā)芽指標測定

激素種子類型發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(%)發(fā)芽指數QPT58.67±8.8160±8.7*30.51±3.58*6-BAQPTi91.33±3.53**91.33±3.5**50.98±3.33**WT52.67±5.3352.67±5.325.46±1.26QPT6.00±1.161.33±0.70.51±0.12ABAQPTi36.67±10.41**24.67±7**6.50±2.09*WT0.67±0.670.00±0.000.04±0.036

注：QPT為超量表達煙草植株;QPTi為干涉表達煙草;WT為野生型煙草。以各組中野生型種子萌發(fā)指標為對照，N=50,“*”代表p<0.05,“**”代表p<0.01。

2.2 轉基因植株的獲得與鑒定

以T1代種子萌發(fā)的煙草幼苗為材料進行GUS染色及PCR驗證,以確定獲得QPT超量和QPT干涉表達穩(wěn)定遺傳的轉基因煙草植株。剪取萌發(fā)至3～5葉期中心葉片進行GUS染色, 超量表達和干涉表達煙草幼葉均染成藍色, 野生型未出現(xiàn)變化(圖1 A);進一步對2種轉基因煙草GUS染色陽性的植株進行PCR擴增,分別從超量表達煙草和干涉表達煙草中擴增到大小為750 bp和500 bp的特異性條帶(圖1 B),說明QPT超量表達片段與QPT干涉片段已經完全整合到煙草基因組中并能進行穩(wěn)定的遺傳。生長后期, 野生型植株生長狀態(tài)顯著優(yōu)于兩種轉基因植株(圖1 C)。

2.3 激素處理對煙草形態(tài)指標的影響

植物激素通過調節(jié)其在植株內的和表達水從而影響植物個體的生長發(fā)育,研究分別以20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA對轉基因和非轉基因煙草進行噴施處理以研究不同激素對QPT干涉煙草植株形態(tài)的影響。研究結果表明,以清水處理的超量表達和干涉表達QPT煙草在第7、14天和第21天的葉片數、株高、葉寬、葉長和莖圍等指標都顯著高于野生型植株(表1,表2,表3),但以40 mg/L 6-BA對煙草植株進行處理時, 發(fā)現(xiàn)轉基因(QPT和QPTi)和野生型植株在各測定各時期(處理第7、14天和第21天)的形態(tài)指標均受到一定程度抑制, 其中以第21天時6-BA對野生型煙草的葉片數、株高、葉寬和葉長指標抑制程度最高,QPT煙草次之,QPTi煙草最低; 與QPTi煙株相比較,以40 mg/L 6-BA處理第21天時野生型煙草植株下同。

注：QPT為超量表達煙草;QPTi為干涉表達煙草;WT為野生型煙草；M為5 000 bp DNA Marker Ladder；P 1、P 2為陽性質粒對照;Q 1～Q 3為超量表達煙草植株;q 1～q 3為干涉表達煙草植株。圖1 轉基因植株鑒定及生長形態(tài)觀察

表2 激素處理第7天煙草農藝性狀測定

處理基因型農藝性狀葉片數株高(cm)葉寬(cm)葉長(cm)莖圍(cm)QPT10.33±0.58*11.27±2.46*9.92±1.58*16.52±2.55*1.51±0.08*水QPTi10.67±0.58*13.08±0.68*8.24±1.7014.38±2.341.43±0.07WT9.33±1.159.77±2.467.97±0.9314.66±2.551.40±0.10QPT9.67±0.5812.19±0.25*9.03±0.42*15.17±1.291.67±0.03**6-BAQPTi10.33±1.52*14.06±2.65**10.15±0.61*17.28±0.50*1.67±0.05**WT8.67±0.57*9.34±0.258.36±0.6414.51±0.531.67±0.04**QPT9.33±0.578.99±2.018.53±1.0515.64±2.05*1.39±0.14ABAQPTi11.00±1.00*11.88±1.99*7.39±0.32*13.03±0.74*1.41±0.07WT8.67±0.57*8.37±0.38*6.77±0.26*12.74±0.35*1.35±0.15*

注：n=3,“*”為差異顯著(p<0.05)，“**”為差異極顯著(p<0.01),顯著性均與清水對照相比較。

表3 激素處理第14天煙草農藝性狀測定

處理基因型農藝性狀葉片數株高(cm)葉寬(cm)葉長(cm)莖圍(cm)QPT13.33±0.58*22.64±3.58*12.10±0.26*19.92±0.21.84±0.07*水QPTi13.33±0.57*20.91±2.5110.37±1.8517.66±2.38*1.67±0.18WT12.33±1.1520.35±3.7210.57±1.1719.82±2.871.69±0.08QPT13.00±1.00*19.29±3.2410.03±0.6016.81±1.29*1.93±0.156-BAQPTi12.00±1.0021.30±3.2910.78±0.2917.62±0.45*1.84±0.03*WT11.33±0.58*16.74±1.17*9.42±0.55*15.3±0.94**1.93±0.08QPT11.67±0.58*18.25±4.42*9.87±1.26*17.31±2.20*1.71±0.08ABAQPTi13.33±1.52*19.02±1.549.47±0.15*16.17±0.57*1.53±0.32*WT9.67±0.58**14.49±0.96*7.57±0.47**14.19±0.6**1.43±0.11**

葉片數、株高、葉寬和葉長指標的抑制率分別為 81.6%、83.9%、86.7%和87.6%。另外,20 mg/L ABA處理也可抑制3種煙草植株的株高、葉片數和莖圍等指標增加,其中以對野生型煙草抑制最為顯著。研究結果顯示,盡管20 mg/L ABA對煙株的生長也具有抑制作用,但其抑制效果相較40 mg/L 6-BA弱。相較QPTi植株,在ABA處理后第7、14天和第21天時野生型植株的葉片數和株高指標的抑制率分別為78.8%、72.54%、71.1%和70.5%、76.2%、84.5%,表明隨著處理天數的推移對這2個差異最為顯著的指標抑制也減弱。

2.4 激素處理對煙草理化指標的影響

2.4.1 激素處理對煙草SOD酶活性的影響

SOD酶活測定結果表明,2種激素(20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA)處理前,QPTi植株與WT和QPT植株間酶活均存在顯著差異, 但后兩者間SOD酶活無顯著差異,推測QPT基因的干涉能顯著提高干涉植株的氧化保護酶活性。隨著激素處理的推移,ABA和6-BA處理引起的SOD酶活都出現(xiàn)先降低后升高的趨勢, 但酶活的降幅和增幅在不同株系煙草中有一定差異。激素處理QPT、QPTi、WT植株1 d時,其SOD酶分別下降了32.41%、44.13%和17.83%,而ABA處理的分別下降13.36%、42.78%、10.77%,可知3種煙草株系中以QPTi煙草SOD酶活性對2種激素的應答最為顯著,降幅也最大。但當激素處理3 d時,SOD酶活在WT、QPT和QPTi植株中都表現(xiàn)出不同程度的增加,相較處理1 d時SOD酶活,6-BA處理引起超量表達、干涉表達和野生型植株中酶活性分別上升46.03%、46.18%和32.06%,而ABA處理引起的SOD酶活增加分別為31.80%、29.51%和15.51%。

表4 激素處理第21天煙草農藝性狀測定

處理基因型農藝性狀葉片數株高(cm)葉寬(cm)葉長(cm)莖圍(cm)QPT16.67±0.58*30.50±3.5912.79±0.70*21.72±0.89*1.99±0.03*水QPTi16.00±0.00*26.69±3.31*11.16±1.9618.78±1.63*1.82±0.13WT14.67±1.5228.68±3.9311.62±1.1220.73±1.981.84±0.09QPT16.33±0.58*24.74±5.02*10.49±0.97*17.29±1.23*2.12±0.15**6-BAQPTi15.33±2.3025.64±3.34*11.24±0.4717.76±0.431.93±0.02*WT13.33±0.58*21.50±1.82*9.75±0.2*15.55±0.60**2.08±0.14**QPT14.00±0.0025.72±4.6*11.57±0.6720.10±1.441.95±0.04*ABAQPTi15.00±1.0022.53±3.02*9.76±0.2*18.53±0.5*1.67±0.06*WT10.67±2.08**19.04±1.06**8.59±1.02**15.57±1.84**1.52±0.09**

注：QPT為超量表達煙草;QPTi為干涉表達煙草;WT為野生型煙草。下同。圖2 激素處理對煙草SOD酶活性的影響

圖3 激素處理對煙草Ca和Cb含量的影響

2.4.2 激素處理對煙草葉綠素含量的影響

激素ABA和6-BA處理對3種煙草株系的葉綠素a(Ca)和葉綠素b(Cb)均有一定程度影響。就以40 mg/L 6-BA處理而言,該激素對干涉植株Ca含量的抑制程度要高于野生型和超量表達植株。6-BA噴施處理3種煙草植株,在處理第1天時QPT、QPTi和WT植株分別下降16.75%、22.7%和15.35%,到第3天時Ca含量在這3類煙草植株中都有一定程度回升;與6-BA處理結果相同,ABA處理也可引起QPTi、QPT和WT煙株中Cb含量顯著下降,其中對QPTi株系Ca含量的影響較其他2個株系顯著;同時對激素處理后煙草中Cb測定表明,6-BA處理后Cb含量總的也呈下降趨勢,其中以WT降幅最大,達39.63%,QPT和QPTi分別為24.5%、22.08%。但QPTi植株僅在處理第1天時下降幅度最大,為25.08%,之后開始Cb含量開始增加,到處理第3天時增加了4.03%(與處理第1天時比較),而QPT和WT中Cb含量持續(xù)下降;短期內(1 d)ABA處理對WT和QPTi植株的Cb含量影響并不大,但對QPT煙株中的Cb影響較顯著,到第3天時QPT中Cb含量總降幅為29.09%。

圖4 激素處理對煙草Cx和Ct含量的影響

進一步對煙草的類胡蘿卜素含量(Cx)和葉綠素總含量測定結果表明,20 mg/L ABA和40 mg/L 6-BA處理后煙草的類胡蘿卜素(Cx)合成受到抑制,進而引起Cx含量下降,其中以6-BA處理對Cx含量抑制影響效應高于ABA處理。QPT與QPTi植株中Cx含量的降幅相當且較大,分別為32.15%和31.97%,而WT植株Cx含量下降較低,僅為20.23%;ABA處理引起的QPTi、WT和QPT煙株Cx含量下降分別18.42%、16.15%和14.90%,相較6-BA處理顯著低,在3 d時又有一定程度的增加。2種激素引起的植株葉綠素總含量(Ct)總體呈下降趨勢,同樣以6-BA處理的煙苗影響較大,其中QPTi煙株對6-BA最為敏感，處理后第1天時降幅即達到23.01%，第3天時又下降7.05%,而QPT和WT中Ct含量總體降幅不及QPTi顯著,但兩者下降趨勢一致。以上研究,一方面高濃度細胞分裂素(6-BA)對煙株生長有一定的抑制作用,另一方面QPT基因干涉后通常會表現(xiàn)出對高濃度植物激素具有較敏感的效應,推測QPT具有調節(jié)植物在應答高濃度植物激素脅迫生長的代謝過程中具有一定的延緩效應。

3 討論與結論

QPT不僅是催化煙草煙堿合成的限速酶,也是催化生物體眾多酶的輔酶NAD從頭合成的關鍵酶,對植物體的生長發(fā)育起著重要的調控作用[12-13]。另外,植物激素對植物種子萌發(fā)[14]、生長發(fā)育[15]以及品質[16]也同樣具有顯著的影響。本研究以外源激素對種子和種苗進行處理,分析QPT超量表達及干涉表達轉基因煙草材料對激素的應答效應,以探討激素調控下QPT對煙草萌發(fā)生長的調控作用。一方面,低濃度5 mg/L 6-BA能顯著促進QPTi種子的萌發(fā),萌發(fā)指標發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數與WT、QPT相比呈極顯著,QPTi種子的發(fā)芽率與WT、QPT相比分別增加73.40%、55.67%,6-BA是一種植物細胞分裂素,具有促進植物芽分化、提高種子活力的功能[17]。但而高濃度40 mg/L 6-BA對QPT、QPTi和WT煙草均產生一定程度的抑制作用,農藝性狀如株高、葉寬、葉長等生長都受到影響，其中以對QPT和WT的葉長指標的抑制最顯著,分別為15.59%和33.34%,以上結果與成丹等[18]研究不同濃度6-BA對大豆生長萌發(fā)影響的結果相似。另一方面,低濃度ABA和高濃度ABA可分別抑制種子萌發(fā)和煙株生長。當以2 mg/L ABA處理的煙草種子時,相比較QPTi植株,WT種子受抑制程度最大為98.2%,QPT種子其次,為82.64%;當以20 mg/L ABA處理煙草時,ABA又會顯著抑制QPTi和WT的株高、葉長、葉寬、莖圍等形態(tài)指標生長,其中以對WT植株的抑制程度最大,QPTi次之,對QPT植株抑制程度最小,ABA對前兩者株高指標的抑制率分別為33.59%和21.42%。ABA是一種植物生長抑制劑,具有調控葉片衰老、減緩不良環(huán)境脅迫、影響種子萌發(fā)的作用[19]。王熹等[20]報道了外源植物激素ABA(脫落酸)抑制水稻種子發(fā)芽的實質是延緩種子發(fā)芽,ABA的處理引起種子體內代謝過程緩慢并最終使得種子萌發(fā)率下降,推測本實驗中由于統(tǒng)計種子萌發(fā)天數的限制導致短期內ABA處理的種子萌發(fā)率低。另外,本實驗結果與匡勇等[21]報道的脫落酸(ABA)對植物生長發(fā)育具有促進作用結論不同,可能是本研究所選的ABA處理濃度仍較高，導致表現(xiàn)出抑制煙草種子萌發(fā)的效應。另外,激素處理前QPTi植株SOD酶顯著高于另外兩種植株,推測QPTi煙草由于QPT基因干涉導致煙堿含量下降,而后者在抗病、抗蟲方面具有顯著的作用,故其遭到蟲害及不良環(huán)境的可能性增高,導致QPTi植株處于較高的SOD酶活性。激素處理后所有煙草株系均表現(xiàn)出先降后升的趨勢,其中對轉QPTi煙草的影響較大，6-BA與ABA處理1 d分別下降44.13%、42.78%,各激素處理后SOD酶活性在第3天后QPT、WT、QPTi的SOD酶活性能呈現(xiàn)出一致性。激素處理的煙苗各葉綠素含量變化有一定差異,且激素處理對QPTi總葉綠素含量影響也是最大的，其下降趨勢高于QPT和WT植株。說明QPT基因的正?；虺勘磉_對應答高濃度激素介導的生長抑制作用具有一定的補償作用,以消除該抑制效應引起的植物生長延滯現(xiàn)象。