鉻-銅復合脅迫對鳳仙花種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

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(佳木斯大學生命科學學院， 黑龍江 佳木斯 154007)

重金屬污染已經(jīng)成為當今世界上危害嚴重的污染之一。重金屬主要通過采礦、電鍍、油漆等工業(yè)而排出，進而間接或直接地對植物造成危害，嚴重影響人類健康[1]。銅是一種有毒的重金屬元素，而且還是環(huán)境中最主要的重金屬污染物。在植物生長發(fā)育過程中銅是必需的營養(yǎng)元素之一，但過多的銅可以抑制植物光合作用，且引起葉色失綠，從而抑制植物生長。鉻不僅是環(huán)境當中廣泛存在于的“五毒”元素之一，還是一種有毒、致畸和致突變的元素。土壤中共存的鉻和銅對土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)的影響已經(jīng)得到越來越多的研究人員關注[2-4]。植物修復具有很多優(yōu)點，是重金屬污染修復的一種切實有效方法。因此尋找到既能對重金屬具有積累又具有抗性能力的植物，無疑對受污染土壤的修復具有重要意義。用鳳仙花作研究對象，研究重金屬鉻和銅復合脅迫對其種子萌發(fā)及生理指標的影響，既可以避免生物體誤食保證生物體安全，又可以作為觀賞植物美化環(huán)境，同時也為重金屬污染土壤的植物修復提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鳳仙花種子來自于佳木斯市西林種子公司。重金屬添加形式為硫酸銅和氯化鉻。

1.2 水培設計

挑選飽滿均勻的鳳仙花種子，將種子浸于濃度為0.4%的高錳酸鉀溶液里消毒15 min，取出后用蒸餾水反復沖洗干凈，再用不同濃度的Cr-Cu混合溶液浸泡種子2 h。取玻璃培養(yǎng)皿并在每個培養(yǎng)皿中墊2張濾紙，將不同濃度的Cr-Cu混合溶液加入培養(yǎng)皿中，在每個培養(yǎng)皿中均勻放入50粒鳳仙花種子，對照組采用蒸餾水培養(yǎng)。每處理均為3次重復，共7個處理，Cr-Cu復合處理及對照組濃度見表1。為了使種子處于濕潤狀態(tài)，在培養(yǎng)皿種子的上方鋪2層紗布(生根后取出)。之后把培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱內，每天添加相應濃度的Cr-Cu溶液或蒸餾水，保持每皿相應的濃度。在第5天測定發(fā)芽率、葉綠素含量、根系脫氫酶活力以及超氧化物歧化酶活性等指標。

表1 Cr-Cu處理濃度

處理Cr3+(mg/L)Cu2+(mg/L)10022010340204804051608063201607640320

1.3 葉綠素含量測定

葉綠素含量測定采用比色法[5]。從各處理組幼苗上分別取0.1 g葉片，用剪刀剪碎后放入研缽中，加入2～3 mL 95%乙醇溶液、少量碳酸鈣粉和石英砂研磨到組織變白勻漿，停止，放置5 min。過濾提取液到10 mL試管中，之后用少許乙醇沖洗殘渣、研棒及研缽數(shù)次并過濾干凈，用乙醇定容至10 mL，搖勻。將葉綠素提取液倒入光徑1 cm的比色杯內，空白對照用95%乙醇，在波長為645 nm、663 nm下測定吸光度，計算葉綠素的含量。

1.4 根系活力測定

根系活力測定采用四氮唑(TTC)法[6]。稱量各處理組根尖0.5 g，置于燒杯中，并加入磷酸緩沖液和0.4%TTC溶液的等量混合液10 mL，把根完全浸入溶液中，置于37 ℃黑暗條件下保溫1～3 h，取出后往燒杯中倒入2 mL的1 mol/L硫酸，使反應停止(同時做一個空白試驗)。取出根之后，把根表面的水分吸干后放入研缽，并在缽內加入少量石英砂及3～4 mL乙酸乙酯一起研磨，提取出三苯基甲腙。之后把提取出的紅色液體轉移到試管中，將殘渣用少許乙酸乙酯洗滌2～3次，一并轉入試管中，最終用乙酸乙酯定容至10 mL。以空白試驗作參照，用分光光度計測量在波長485 nm下吸光度，測定3次，查標準曲線，即可求出TTC還原量，計算出根系活力。

1.5 超氧化物歧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用鄰苯三酚自氧化法[7]。取10μL的50 mmol/L鄰苯三酚，充分搖勻，以緩沖液做空白對照，每30 s測定1次吸光度。在相同條件下加入10μL待測SOD液，讀取其吸光度。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 鉻和銅對鳳仙花種子萌發(fā)的影響

發(fā)芽率可以反映出種子的出苗情況。不同濃度Cr-Cu復合溶液對鳳仙花種子的發(fā)芽率有一定影響。如圖1，當Cr-Cu處理濃度在(80，40)mg/L以下時，與對照組相比，鳳仙花種子的發(fā)芽率呈上升趨勢，這表明在低濃度范圍內Cr-Cu溶液對鳳仙花種子的發(fā)芽有一定的促進作用。當處理濃度達到(160，80)mg/L時，發(fā)芽率開始下降，但與對照組相比差異不顯著(p>0.05)。隨著Cr-Cu濃度的進一步增高，種子發(fā)芽率明顯下降，與對照組差異顯著(p<0.05)，說明Cr-Cu復合脅迫對鳳仙花萌發(fā)產(chǎn)生了抑制作用。

注：不同字母表示差異達顯著水平(p<0.05)。圖1 不同濃度鉻和銅對鳳仙花種子發(fā)芽率的影響

2.2 鉻和銅對鳳仙花幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素與植物的光合作用有十分重要的關系，其含量在一定程度上決定同化物質的能力。從表2可以看出，隨著Cr-Cu復合脅迫濃度的增加，葉綠素a、葉綠素b以及葉綠素總含量都呈先增加后下降的趨勢，在(80，40)mg/L處理下達到最高，在(640，320)mg/L處理下最低(低于對照組)。表明低濃度的脅迫對葉綠體的合成具有促進作用，隨著脅迫濃度的增大，重金屬的毒害作用就會顯現(xiàn)出來，從而阻礙葉綠素的合成，影響植物的光合作用。同時還發(fā)現(xiàn)在Cr-Cu處理濃度范圍內葉綠素a/b比值是一直下降的，且葉綠素a含量的降幅大于同組葉綠素b的降幅，表明葉綠素a比葉綠素b更容易受到Cr-Cu復合脅迫的影響。

表2 不同濃度鉻和銅對鳳仙花幼苗葉綠素含量、根系活力和SOD的影響

Cr-Cu濃度(mg/L)葉綠素a(mg/g)葉綠素b(mg/g)葉綠素a+b(mg/g)葉綠素a/b根系活力[μg/(g·h)]SOD(U/g)(0,0)10.68±0.89a4.31±0.23a14.99±1.12a2.4854.6±1.43a260±6.76a(20,10)10.93±0.91a4.64±0.27ab15.57±1.23b2.3653.0±1.65a285±7.34a(40,20)11.21±0.86b4.85±0.32b16.06±1.16c2.3150.4±3.23a330±8.96b(80,40)11.56±0.73c5.02±0.35b16.58±1.08d2.3046.8±2.98a360±11.23c(160,80)10.98±0.65ad4.98±0.28b15.96±0.91c2.2040.2±2.31b390±9.45d(320,160)10.12±0.57e4.80±0.29c14.92±0.86a2.1137.6±2.73b350±10.67e(640,320)8.46±0.49f4.29±0.19d12.75±0.68e1.9732.6±1.76c310±12.00e

2.3 鉻和銅對鳳仙花幼苗根系活力的影響

根系活力是衡量根系生長質量的重要指標。根系活力越高，則根系組織的代謝就越旺盛，植株生長狀況就越好。因為根部是接觸重金屬的直接部位，所以重金屬很容易影響植物的根系活力。由表2可知，鳳仙花幼苗在所有Cr-Cu處理濃度范圍內根系活力隨濃度增加而下降。Cr-Cu在(80，40)mg/L以下處理濃度，與對照組相比幼苗的根系活力沒有出現(xiàn)明顯的差異，說明這一濃度以下的Cr-Cu對鳳仙花幼苗的生長沒有太大的影響，不產(chǎn)生毒害作用。隨著Cr-Cu濃度高于(160，80)mg/L處理，鳳仙花幼苗的根系活力明顯下降，說明從此濃度開始產(chǎn)生了毒害作用，且Cr-Cu的濃度越高對幼苗的毒害作用越重。

2.4 鉻和銅對鳳仙花超氧化物歧化酶活性的影響

超氧化物歧化酶在植物呼吸代謝過程中起著非常重要的作用，其活性是監(jiān)測植物受重金屬毒害的重要生理指標。從表2可以看出，當Cr-Cu復合脅迫濃度在(20，10)mg/L時，其SOD的活性與對照組相比有所增加，但不顯著。隨著Cr-Cu復合脅迫濃度的不斷增加，SOD的活性顯著增加，當濃度達到(160，80)mg/L時，SOD的活性最大。當濃度達到(320，160)mg/L以上時，SOD的活性有所下降，但比對照組高。因此，高濃度的Cr-Cu對鳳仙花幼苗的生長具有抑制作用。

3 結論與討論

在重金屬脅迫下，萌發(fā)期和苗期植物生長的變化通常被作為評價植物重金屬忍耐度的重要指標[8]。試驗結果表明，較低濃度的Cr-Cu復合脅迫對鳳仙花種子萌發(fā)起到一定刺激作用，而高濃度起到抑制效應，隨著脅迫濃度的增加，對鳳仙花種子萌發(fā)的抑制作用加劇，這與以前的研究結果一致[9]。導致種子萌發(fā)率低促高抑現(xiàn)象的原因可能是低濃度Cr-Cu可增加胚的生理活性，促進種子萌發(fā)；而高濃度Cr-Cu對胚、芽等產(chǎn)生了傷害作用，抑制了種子內貯藏蛋白質和淀粉的分解，從而影響種子萌發(fā)所需的物質和能量，導致種子萌發(fā)率下降[10]。

綠色植物進行光合作用主要靠葉綠素，含量高說明植物生長狀況好、光合作用強。試驗中，Cr-Cu在(80，40)mg/L的濃度以下進行處理，葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量有上升趨勢，表明Cr-Cu復合脅迫使鳳仙花幼苗具有一定的防御性，低濃度刺激使葉綠素含量增加，這可能與鳳仙花本身的抗性機制有關，細胞內的金屬蛋白結合了外來的有毒金屬離子，導致重金屬離子的毒害作用被解除。提高Cr-Cu的處理濃度，重金屬的毒害作用就會顯現(xiàn)出來，其原因可能是Cr-Cu與相關酶相互作用，阻礙了葉綠素前體的合成，導致葉綠素分解，或直接破壞葉綠體結構阻礙葉綠素合成，導致葉綠素含量降低。有的研究認為，葉片衰老的過程伴隨著葉綠素a/b值同時下降[11]，試驗中葉綠素a/b值隨處理濃度的升高而下降，表明Cr-Cu復合脅迫使葉片加速衰老。

隨著Cr-Cu脅迫濃度的增加對鳳仙花幼苗根系活力的影響表現(xiàn)為逐漸下降，濃度越高，下降幅度越大。這個結果與鎘對烤煙幼苗根系活力的影響相一致[12]。其原因在于重金屬脅迫下產(chǎn)生的自由基超過植物本身抗氧化系統(tǒng)酶的清除能力，過量的自由基會破壞根系代謝中的琥珀酸脫氫酶活性，從而降低根系活力。

在不同濃度Cr-Cu脅迫下，SOD活性先升高后下降。SOD是植物體內清除活性氧自由基的重要酶，低濃度Cr-Cu能提高幼苗SOD的活性，使植物體清除自由基的能力加強，從而防止植物細胞中毒，表現(xiàn)為SOD活性上升。在高濃度Cr-Cu處理后使超氧自由基數(shù)量超過鳳仙花的耐受極限，使SOD活性受到抑制。

鳳仙花對鉻和銅具有一定的抗性，利用鳳仙花對受重金屬污染的土壤進行修復時需考慮鉻和銅的治理效率問題。由于鉻和銅脅迫對鳳仙花生長發(fā)育的影響是多方面的，具體的機制還有待于進一步探討。