熊果酸抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡降低局灶性腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究

隨著人口老齡化的加速，我國(guó)缺血性腦血管病發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，臨床上采取緊急藥物溶栓及介入手術(shù)等治療手段雖然能夠挽救部分病人生命，但缺血再灌注損傷仍嚴(yán)重影響著該類病人預(yù)后。Wang 等[1]研究發(fā)現(xiàn)繼發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦組織缺血再灌注損傷重要的病理基礎(chǔ)，因此以抑制細(xì)胞凋亡為靶點(diǎn)研究新型藥物，或許是降低缺血再灌注損傷的新途徑。熊果酸(ursolic acid， UA)是一種五環(huán)三萜類化合物，陳鵬等[2]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能夠通過(guò)改善抗氧化酶活性、降低氧化應(yīng)激損傷而表現(xiàn)出對(duì)腦缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用，周寧等[3]和趙瑞芳等[4]研究發(fā)現(xiàn)熊果酸通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡而對(duì)腸系膜缺血損傷和心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，但熊果酸是否對(duì)腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有抑制作用尚少有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠模型并腹腔注射熊果酸進(jìn)行治療，研究熊果酸不同劑量對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用，進(jìn)而探討其對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 熊果酸購(gòu)自陜西慧科植物開發(fā)有限公司，純度≥98%，20141125；TUNEL試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；AKT、bcl-2、Bax上下游引物購(gòu)自上海博亞生物公司；caspase-3、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)單克隆抗體購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠，7周齡，260 g～300 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(冀)2013-1-003。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與模型制備 取100只實(shí)驗(yàn)用SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和熊果酸低劑量組(20 mg/kg)、中劑量組(40 mg/kg)、高劑量組(80 mg/kg)，每組20只。模型組及熊果酸各劑量組大鼠均參照Longa 等[5]報(bào)道的線栓法復(fù)制模型；假手術(shù)組大鼠除不插入栓線外，其余手術(shù)操作同模型組；熊果酸各劑量組分別于再灌注前30 min通過(guò)腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組同步給予等體積生理鹽水。再灌注24 h后進(jìn)行各指標(biāo)的觀察和檢測(cè)。

1.3.2 神經(jīng)功能評(píng)分 參照10分制評(píng)分方法行盲法評(píng)分：置地上，向缺血對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈，計(jì)1分；提鼠尾，缺血對(duì)側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋，分別計(jì)1分、2分、3分；對(duì)側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降，據(jù)下降程度計(jì)1分～3分；置金屬網(wǎng)上，據(jù)缺血對(duì)側(cè)肌張力下降程度計(jì)1分～3分。

1.3.3 腦組織含水量和梗死體積的測(cè)定 麻醉后斷頭取腦，去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織重量，即為濕重量(W)；110 ℃恒溫烘烤48 h后稱重為干重量(D)：腦含水量(%)=[(W-D)/W]×100%；麻醉后斷頭取大腦組織，沿冠狀切片(厚度約2 mm)，置于1% TTC染色液中恒溫(37 ℃)避光孵育30 min(正常腦組織呈紅色、梗死區(qū)呈蒼白色)，然后通過(guò)圖像分析軟件Imagepro Plus 6.0計(jì)算梗死體積百分比。

1.3.4 腦組織結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變的觀察 取大腦組織并依次經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、脫蠟水化等處理后，行TUNEL染色并通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況(細(xì)胞核黃染為陽(yáng)性著色)。凋亡指數(shù)(AI)的計(jì)算：每張切片于相同位置隨機(jī)選取互不重疊的6個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，然后計(jì)算AI：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.5 腦組織中bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的檢測(cè) 查閱并設(shè)計(jì)大鼠Bax、bcl-2、β-actin基因cDNA序列；取大腦組織并研磨勻漿，加入適量TRIzol試劑提取總RNA并測(cè)定總RNA濃度，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)凝膠成像儀觀察并照相；根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)，然后計(jì)算bcl-2/Bax比值。

1.3.6 腦組織caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè) 取腦組織勻漿液，經(jīng)12 000 r/min低溫(4℃)離心10 min后取上清液，然后通過(guò)蛋白免疫印跡法測(cè)定caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)：高溫變性(沸水浴加熱5 min)、上樣(每孔上樣30 μg)，電泳、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色后，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(1∶500)caspase-3、NF-κB、β-actin 4℃過(guò)夜；洗膜，二抗(1∶100)室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色，以β-actin為內(nèi)參，以條帶灰度值測(cè)定caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)相對(duì)量并計(jì)算Bax/bcl-2比值。

2 結(jié) 果

2.1 熊果酸對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦梗死體積的影響 模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和腦梗死體積較假手術(shù)組均升高(P<0.01)；與模型組比較，熊果酸中、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量和腦梗死體積均降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分、腦組織含水量及腦組織梗死體積(±s)

2.2 熊果酸對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡狀況及AI的影響 模型組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多，而熊果酸各劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量較模型組均明顯減少，以熊果酸高劑量組效果最為顯著。模型組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI較假手術(shù)組升高(P<0.01)；熊果酸中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞AI較模型組降低(P<0.01)。詳見圖1、表2。

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為熊果酸低劑量組；D為熊果酸中劑量組；E為熊果酸高劑量組。

表2 各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞AI比較(±s)%

2.3 熊果酸對(duì)大鼠腦組織bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)的影響 模型組腦組織bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)較假手術(shù)組上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，bcl-2/Bax比值降低(P<0.01)；熊果酸中、高劑量組大鼠bcl-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，Bax mRNA下調(diào)，bcl-2/Bax比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)及bcl-2/Bax比值(±s)

2.4 熊果酸對(duì)大鼠腦組織caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)的影響 模型組腦組織caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)較假手術(shù)組上調(diào)(P<0.01)；熊果酸中、高劑量組caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)較模型組均下調(diào)(P<0.05或P<0.01)。詳見圖2、表4。

圖2 各組大鼠腦組織NF-κB、caspase-3蛋白表達(dá)電泳圖

A為假手術(shù)組；B為模型組；C為熊果酸低劑量組；D為熊果酸中劑量組；E為熊果酸高劑量組。

表4 各組大鼠腦組織中caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)(±s)

3 討 論

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序化死亡過(guò)程，由多種基因參與調(diào)控，其中bcl-2為抑凋亡基因而Bax為促凋亡基因，二者間相互作用、共同參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過(guò)程[6]；Bax能夠與bcl-2聚合成二聚體，從而抑制bcl-2活性而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，所以Bax/bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)Bcl-2基因家族對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[7]。Caspase是激活各種凋亡刺激因子的關(guān)鍵蛋白酶，參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[8]。NF-κB是一種多效能核轉(zhuǎn)錄因子，Zhang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)，誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；生理狀態(tài)下NF-κB以無(wú)活性形式存在于胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞受到細(xì)胞活性氧(ROS)攻擊時(shí)，NF-κB將被活化并暴露出核定位信號(hào)而進(jìn)入胞核內(nèi)，與凋亡相關(guān)基因如c-myc等NF-κB調(diào)控元件結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]；此外，活化的NF-κB蛋白還能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤(rùn)、誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)熊果酸(40～80)mg/kg干預(yù)治療能夠顯著改善局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能癥狀，降低腦梗死體積和腦組織含水量。與模型組比較，經(jīng)熊果酸(40～80)mg/kg治療能夠抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡并降低凋亡指數(shù)；上調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)、下調(diào)Bax mRNA表達(dá)，提高bcl-2/Bax比值，下調(diào)caspase-3、NF-κB蛋白表達(dá)。提示熊果酸可能通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡而對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與熊果酸調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)有關(guān)。