芝麻香微生物的研究與應(yīng)用

張聰芝，陸其剛，陳 力，張龍云，胡風(fēng)光，陳孚江，蒲 春，劉 亮

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷223800)

芝麻香型白酒是建國以來創(chuàng)新形成的香型之一，周恒剛、沈怡方等老前輩對芝麻香生產(chǎn)技術(shù)及生產(chǎn)工藝進(jìn)行了總結(jié)，即生產(chǎn)原料的高氮配比、汲取醬香型白酒的高溫堆積、高溫入窖工藝，并開創(chuàng)了麩曲純菌種微生物生產(chǎn)芝麻香酒的模式，同時推動了芝麻香曲及釀酒生產(chǎn)的機(jī)械化、自動化。江蘇洋河酒廠股份有限公司在前期研究的基礎(chǔ)上創(chuàng)新性地總結(jié)研究芝麻香微生物，形成了集微生物代謝、機(jī)械化制曲、機(jī)械化釀酒等芝麻香系統(tǒng)體系[1-2]。

1 洋河芝麻香特性微生物代謝研究

洋河釀酒微生物技術(shù)研發(fā)團(tuán)隊經(jīng)過多年潛心研究，從生理特性、多酶代謝、風(fēng)味代謝等方面對芝麻香微生物代謝機(jī)理進(jìn)行了研究，確立了洋河芝麻香復(fù)合微生物、復(fù)合酶系以及特性風(fēng)味化合物方面形成的特有風(fēng)格[1-3]。

1.1 芝麻香微生物生理特性研究

1.1.1 微生物分類地位

通過顯微特性、菌落特性以及生化鑒定，初步形成了芝麻香微生物的顯微形態(tài)、菌落形態(tài)、基礎(chǔ)生化等基礎(chǔ)特征：如酵母呈乳白色中間凸起菌落、產(chǎn)膜、發(fā)酵較強(qiáng)、芽生率較高分裂快；芽孢桿菌特有的芽孢、菌落圓形及不規(guī)則、可產(chǎn)色素；霉菌在淀粉培養(yǎng)中有明顯的透明圈，分生孢子梗長短不一等特性。同時委托中國食品發(fā)酵研究院運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定，確認(rèn)白曲為半知菌亞門真菌屬河內(nèi)白曲，酵母為漢遜酵母（Hansenula anomala）、酒香酵母（Saccharomyces cerevisiae）、德克酵母（Dekkera）等；細(xì)菌為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等；多種類芝麻香微生物豐富了正在籌建的優(yōu)質(zhì)洋河酒釀造微生物菌種庫。微生物顯微及菌落形態(tài)圖見圖1。

圖1 微生物顯微及菌落形態(tài)圖

1.1.2 特性生長規(guī)律（圖2）

圖2 芝麻香微生物（生香酵母）菌體生長曲線

經(jīng)過定向選育的3類芝麻香微生物無論是細(xì)菌分裂、酵母芽殖等都具有繁殖迅速的特點(diǎn)，細(xì)菌與酵母一般經(jīng)過2～3 h的延滯期迅速進(jìn)入對數(shù)期，8～10 h進(jìn)入穩(wěn)定期，進(jìn)入產(chǎn)酶及風(fēng)味代謝階段，白曲在大盤培養(yǎng)到12～16 h時，菌絲生長迅速密布盤面進(jìn)入淀粉酶、蛋白酶旺盛期，持續(xù)旺盛期至32 h左右進(jìn)入生長后期（表1）。

表1 菌體濃度統(tǒng)計表 (×109個/g)

3類芝麻香微生物在種子培養(yǎng)階段及機(jī)械化圓盤培養(yǎng)階段繁殖迅速，逐漸形成優(yōu)勢數(shù)量的微生物類群，這是高效代謝相關(guān)酶系，代謝典型化合物，形成洋河芝麻香典型風(fēng)格的基礎(chǔ)；經(jīng)近期研究統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)單品酵母曲酵母數(shù)量達(dá)到109個/g以上，細(xì)菌達(dá)到109個/g，白曲孢子含量達(dá)到1010個/g。

1.2 芝麻香微生物代謝特性研究

1.2.1 特性多酶代謝

通過研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，河內(nèi)白曲、芽孢桿菌、漢遜酵母每種微生物具有特定的產(chǎn)酶特性，河內(nèi)白曲以高產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶為主；芽孢桿菌兼具中性酸性蛋白酶活力（表2），高蛋白酶活力是分解含氮物質(zhì)形成美拉德反應(yīng)前驅(qū)物的基礎(chǔ)，也是形成細(xì)菌曲及芝麻香曲典型風(fēng)味的前提；酵母則以高效的發(fā)酵產(chǎn)酒、生香為主，高發(fā)酵力對于后期堆積升溫、霉層生長有利。

洋河選育的芝麻香微生物既具有芝麻香曲行業(yè)中微生物的共性，又有典型個性，不同活性和不同酶類的特性組合形成了洋河特有風(fēng)格體系。

1.2.2 特性風(fēng)味代謝

江蘇洋河酒廠股份有限公司依托風(fēng)味物質(zhì)研究室深入研究了芝麻香微生物代謝的特征風(fēng)味，通過純種條件下固態(tài)液態(tài)培養(yǎng)，運(yùn)用氣相色譜（GC）及氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）分析，確立了不同菌株風(fēng)味代謝共性及特性，明確了醋酉翁、3-甲硫基丙醇、2,3-丁二醇、β-苯乙醇、四甲基吡嗪、呋喃類、愈創(chuàng)木酚等典型風(fēng)味化合物定性、定量代謝特征（表3）。

酵母以發(fā)酵為主兼顧產(chǎn)香，其中4#菌愈創(chuàng)木酚單株最高產(chǎn)量達(dá)到98.43×10-10g/g，5#菌單株β-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到24.67×10-10g/g（如表3）；嗜熱芽孢桿菌以產(chǎn)吡嗪類、多酚類、吡啶等雜環(huán)類化合物為主，江南大學(xué)最新研究發(fā)現(xiàn)的四甲基吡嗪由微生物代謝產(chǎn)生[5]，其中139#細(xì)菌四甲基吡嗪單株最高產(chǎn)量達(dá)到23.45×10-10g/g（表4），基于此為典型菌株的強(qiáng)化應(yīng)用提供了依據(jù)，為多組合混合發(fā)酵、多種類不同配比芝麻香曲生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。洋河芝麻香微生物風(fēng)味代謝特性是構(gòu)成洋河芝麻香風(fēng)格特性的基礎(chǔ)。

表2 芝麻香成品曲綜合酶活力表

表3 酵母特性化合物定量分析表

1.3 芝麻香微生物多菌種混合發(fā)酵研究

傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)為多菌種混合發(fā)酵模式，白酒微生物的研究是從混合到分離純化研究到混合發(fā)酵研究應(yīng)用（混合-分離-混合），是傳統(tǒng)發(fā)酵的未知到純種分離后的明確再到純種混合的深入，正是這種模式引領(lǐng)白酒釀造從未知到已知促進(jìn)科研的進(jìn)步。江蘇洋河酒廠股份有限公司本著依托生產(chǎn)、專注科研、服務(wù)生產(chǎn)的原則從三角瓶細(xì)菌混合發(fā)酵研究、發(fā)酵罐酵母混合發(fā)酵研究到配方組合混合發(fā)酵研究取得了一系列成果。

1.3.1 酵母混合發(fā)酵研究

基于酵母固液態(tài)純種發(fā)酵的研究為充分發(fā)掘酵母高發(fā)酵力及產(chǎn)香能力，對發(fā)酵罐混合發(fā)酵進(jìn)行跟蹤測定，綜合分析糖消耗，發(fā)酵產(chǎn)酸，菌體濃度情況（圖3）；同時利用配方組合設(shè)計進(jìn)行固態(tài)模擬混合發(fā)酵，經(jīng)驗證確定了酵母優(yōu)勢產(chǎn)香性能組合。

隨著菌體生長發(fā)酵酸度逐步積累，菌體濃度在16 h以前，按延滯期—對數(shù)期—穩(wěn)定期生長，16 h達(dá)到波峰，菌體濃度降低后，28 h左右再次達(dá)到波峰，發(fā)酵液糖濃度也出現(xiàn)相應(yīng)的波動，確定了混合發(fā)酵過程菌體生產(chǎn)代謝的規(guī)律。

同時，經(jīng)過10種配方組合條件下模擬固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗，分析代謝風(fēng)味物質(zhì)情況結(jié)合發(fā)酵力、酯化率指標(biāo)確定了一種優(yōu)化組合4（表5），此種比例下代謝4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量達(dá)到9.95×10-10g/g，β-苯乙醇低于純培養(yǎng)的產(chǎn)量。鑒于發(fā)酵罐混合發(fā)酵生產(chǎn)情況以及模擬配方組合混合發(fā)酵的數(shù)據(jù)，為酵母曲圓盤工藝的探索奠定了理論基礎(chǔ)。

1.3.2 細(xì)菌混合發(fā)酵研究

河內(nèi)白曲以分解淀粉為主，功能酵母以發(fā)酵產(chǎn)酒為主，功能細(xì)菌即芽孢桿菌以代謝四甲基吡嗪、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等典型化合物，依托純種發(fā)酵典型化合物的定性定量分析，采用配方組合設(shè)計模擬固態(tài)發(fā)酵，研究最佳混合發(fā)酵模式，對比分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗?zāi)M組合8四甲基吡嗪同比其他組合產(chǎn)量最高，按照8#組合進(jìn)行5株菌重復(fù)發(fā)酵驗證，經(jīng)過測定分析，四甲基吡嗪含量達(dá)到130.85×10-10g/g，遠(yuǎn)高于單株菌最高產(chǎn)量，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚達(dá)到68.94×10-10g/g（表6），遠(yuǎn)高于酵母產(chǎn)量，進(jìn)一步驗證了細(xì)菌代謝是產(chǎn)生芝麻香典型風(fēng)味的主體[6-7]。

表4 細(xì)菌特性化合物定量分析表 (×10-10g/g)

圖3 酵母液態(tài)混合發(fā)酵菌體生長代謝綜合分析圖

表5 酵母混合發(fā)酵模擬組合指標(biāo)分析表

表6 細(xì)菌混合發(fā)酵模擬組合指標(biāo)分析表 (×10-10g/g)

2 機(jī)械化圓盤制曲工藝研究

2.1 CM-7機(jī)械化圓盤中試工藝探索

2.1.1 培養(yǎng)條件研究

對芝麻香微生物的培養(yǎng)基及部分培養(yǎng)條件進(jìn)行了大量的科研實(shí)驗，從斜面菌株到三角瓶培養(yǎng)，從發(fā)酵罐增殖到圓盤培養(yǎng)進(jìn)行了逐級優(yōu)化，確定了培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件。

(1)選取大米、玉米粉、麩皮3種不同培養(yǎng)基研究河內(nèi)白曲糖化力和蛋白酶活力情況：即麩皮為基質(zhì)時糖化力最高，玉米粉為基質(zhì)時蛋白酶活力較高，這與芝麻香曲行業(yè)研究具有一致性，同時對比了不同水分含量、不同pH值對白曲代謝產(chǎn)酶的影響，實(shí)驗室條件下70%～80%含水量、pH4.5～5.0時，糖化力和蛋白酶活力維持在較高水平（表7）。

表7 不同培養(yǎng)基質(zhì)酶活力分析表

(2)對比飴糖、葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等培養(yǎng)基，在發(fā)酵罐中的酵母增殖趨勢，發(fā)現(xiàn)多碳源時輔以一定有機(jī)氮源增殖較快（圖4），最終確定了葡萄糖、飴糖及蛋白胨最佳配比，酵母菌數(shù)量在24 h穩(wěn)定在108個/mL左右。

(3)對比入盤細(xì)菌曲數(shù)量、pH值、稻殼用量、外加氮源量等條件，經(jīng)過反復(fù)的探索確定了最佳條件，使嗜熱芽孢桿菌的增殖及風(fēng)味代謝處于最佳水平（圖5），尤其典型風(fēng)味物質(zhì)的代謝，增強(qiáng)了芝麻香曲風(fēng)格的典型性。

圖4 不同基質(zhì)混合培養(yǎng)條件下酵母菌生長趨勢圖

圖5 不同條件下芽孢桿菌增殖趨勢圖

2.1.2 中試擴(kuò)培研究

基于前期研究利用CM-7機(jī)械化圓盤進(jìn)行中試，探索制曲培養(yǎng)過程參數(shù)，提高芝麻香微生物代謝性能，促進(jìn)曲質(zhì)質(zhì)量提升；從入盤溫度、品溫控制、通風(fēng)量、通風(fēng)強(qiáng)度翻曲時間、翻曲次數(shù)等多方面探索白曲、細(xì)菌曲、酵母曲最佳培養(yǎng)條件，確定了最優(yōu)中試培養(yǎng)工藝。

即白曲、酵母曲最佳培養(yǎng)溫度為30～35℃；細(xì)菌曲前期以通風(fēng)增殖為主，后期以靜培養(yǎng)酶增香為主；白曲前期增加翻曲以促進(jìn)菌體萌發(fā)增殖、細(xì)菌后期以少翻、不翻為主，促進(jìn)嗜熱芽孢桿菌代謝產(chǎn)生典型風(fēng)味物質(zhì)；持續(xù)跟蹤酵母生產(chǎn)周期內(nèi)菌體增殖、發(fā)酵力、酸度等指標(biāo)的綜合變化（圖6），展現(xiàn)出一個發(fā)酵周期內(nèi)菌體增殖、產(chǎn)酸及底物消耗等參數(shù)的波動變化。

2.1.3 多微復(fù)配試驗探索

對不同微生物屬內(nèi)及屬間配方組合研究，如嗜熱芽孢桿菌代謝四甲基吡嗪最優(yōu)組合A（如表6）優(yōu)化后四甲基吡嗪產(chǎn)量達(dá)到130.85×10-10g/g；基于此進(jìn)行屬間復(fù)配比例探索，確定最佳組合，使芝麻香微生物增殖特性、產(chǎn)酶特性、代謝性能發(fā)揮到最大。

不同比例復(fù)配曲風(fēng)味代謝分析見表8，結(jié)果表明增加細(xì)菌曲比例可顯著增加芝麻香曲典型風(fēng)味化合物的代謝，增加嗜熱芽孢桿菌的種類可提高四甲基吡嗪的代謝總量。

2.2 CM-13機(jī)械化圓盤制曲工藝研究

基于前期芝麻香微生物代謝特性、混合發(fā)酵模型分析以及制曲中試生產(chǎn)的成功探索，江蘇洋河酒廠股份有限公司進(jìn)一步引進(jìn)CM-13機(jī)械化自動培養(yǎng)圓盤，實(shí)現(xiàn)了芝麻香機(jī)械化、現(xiàn)代化、高效率生產(chǎn)，為高檔芝麻香酒的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；將現(xiàn)代生物工程技術(shù)與白酒生產(chǎn)工藝結(jié)合，充分發(fā)揮了芝麻香微生物的作用，實(shí)現(xiàn)了科研成果的應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化。

圖6 CM-7自動控溫圓盤酵母曲增殖趨勢圖

表8 多微復(fù)配曲典型風(fēng)味化合物比對表 (×10-10g/g)

2.2.1 原料蒸煮滅菌（圖7）

圖7 原輔料投料蒸煮工藝流程圖

芝麻香曲是以麩皮為主要原料經(jīng)過人工培養(yǎng)形成的麩曲，前期研究及行業(yè)總結(jié)發(fā)現(xiàn)麩皮是制作芝麻香曲的良好培養(yǎng)基，添加稻殼及有機(jī)氮源、營養(yǎng)鹽經(jīng)過高溫、高壓旋轉(zhuǎn)蒸煮，完成滅菌及原輔料的熟化，達(dá)到芝麻香微生物最佳的利用和繁殖條件。

表9 原料配比及蒸煮標(biāo)準(zhǔn)

蒸煮即是原料的混合、潤料、滅菌過程，又是淀粉液化、糊化過程，經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗探索確定了芝麻香單品曲原料的配比及蒸煮條件（表9），即添加5%～10%的稻殼作為疏松劑，控制40%～60%的水分含量，0.15～0.22 MPa蒸煮15～30 min，保證了原輔料充分混合均勻，殺滅雜菌，淀粉、蛋白質(zhì)底物充分分解，物料熟而不黏，利于微生物的生長繁殖。

2.2.2 制曲過程控制

蒸煮結(jié)束物料采用風(fēng)冷的模式將物料降溫，風(fēng)送至培養(yǎng)CM-13機(jī)械化自動化控溫圓盤，采用邊入盤邊接種確保接種均勻，通過前期中試探索和生產(chǎn)實(shí)驗洋河已經(jīng)總結(jié)出一整套固態(tài)、液態(tài)菌種擴(kuò)培模式，保證了白曲種子、細(xì)菌酵母種子較高的繁殖性能。制曲工藝見圖8，平面圖見圖9。

圖8 圓盤制曲工藝流程圖

圖9 圓盤制曲過程工藝平面圖

入盤后翻曲均勻可調(diào)取、白曲、細(xì)菌、酵母培養(yǎng)參數(shù)開啟通風(fēng)、控溫、控濕自動培養(yǎng)；根據(jù)不同培養(yǎng)階段生長狀態(tài)，經(jīng)過中試探索、擴(kuò)大培養(yǎng)多批次優(yōu)化，最終確定了最優(yōu)的培養(yǎng)參數(shù)，即初級階段低頻率高風(fēng)溫，旺盛階段高頻率低風(fēng)溫的控溫培養(yǎng)模式，以及高頻率低風(fēng)溫的快速低溫烘干模式，有力保證制曲溫度在最佳范圍，低溫烘干減小酶活力和菌體數(shù)量最小損失。溫度變化見圖10。

圖10 起始入盤至控溫培養(yǎng)溫度變化圖

2.2.3 多微配方復(fù)配

芝麻香單品曲即河內(nèi)白曲、細(xì)菌曲、酵母曲，根據(jù)不同生產(chǎn)需求及前期研究，按照不同復(fù)配比例進(jìn)行多微復(fù)配（圖11），發(fā)揮芝麻香微生物最大優(yōu)勢，增加目的代謝產(chǎn)物，促進(jìn)芝麻香典型風(fēng)格的形成。

圖11 多微復(fù)配工藝流程

經(jīng)過反復(fù)的實(shí)驗論證，按比例復(fù)配后成品芝麻香曲糖化力、蛋白酶活力、發(fā)酵力各項指標(biāo)均達(dá)到芝麻香曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，經(jīng)過中試車間試用芝麻香曲發(fā)酵效果良好，堆積升溫良好、酶層適中、堆積醅香氣濃郁，入池發(fā)酵狀態(tài)良好，目前在江蘇洋河酒廠股份有限公司全面推廣使用，為優(yōu)質(zhì)芝麻香酒的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)[8-10]。

3 結(jié)論與展望

本文系統(tǒng)總結(jié)了近年來江蘇洋河酒廠股份有限公司在芝麻香曲科研及機(jī)械化生產(chǎn)方面的研究進(jìn)展；闡述了芝麻香微生物生長及代謝特性，即多種類多數(shù)量芝麻香微生物的增殖、多酶代謝、典型風(fēng)味特征代謝；以及多菌種混合發(fā)酵過程中菌體協(xié)同、代謝互補(bǔ)等菌體生長及風(fēng)味代謝規(guī)律；通過優(yōu)化CM-7機(jī)械化圓盤中試生產(chǎn)工藝，依托中試探索成功總結(jié)確定CM-13機(jī)械化圓盤原料蒸煮、過程培養(yǎng)等關(guān)鍵性制曲工藝，保證了優(yōu)質(zhì)芝麻香曲的高效供給，為芝麻香酒的釀造及公司在芝麻香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。