腺病毒生產(chǎn)工藝改進

薛亮 王愛霞 歸翔剛

摘 要 在293細胞培養(yǎng)體系中感染腺病毒后，繼續(xù)保持培養(yǎng)液中一定濃度的葡萄糖提供碳源，以維持宿主細胞更好的生命狀態(tài)，促進腺病毒的復制、裝配、釋放，達到提高單批次病毒生產(chǎn)的產(chǎn)量。在病毒活性比穩(wěn)定的前提下，改進后病毒顆粒數(shù)（產(chǎn)量）有41.1%的提升。

關(guān)鍵詞 293細胞 腺病毒 殘?zhí)强刂?/p>

中圖分類號：Q813.11 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2018）15-0072-03

Improvement of the process for adenovirus production

XUE liang*， WANG Aixiang， GUI Xianggang

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT After infection of adenovirus in the 293 cell culture， a certain concentration of glucose was continuously supplied in the culture medium to maintain the host cell in a better growth condition so as to promote the replication， assembly and release of the adenovirus and to improve the yield of single-batch virus production. The number of virus particles （production） could be improved by 41.1% on the premise of a stable virus activity ratio.

KEY WORDS 293 cell； adenovirus； residual sugar control

隨著生物制藥的普及和發(fā)展，病毒活載體疫苗的研制成為基因工程疫苗研制的熱點，其中，腺病毒由于具有獨特的優(yōu)勢，成為疫苗載體應(yīng)用中不可缺少部分[1]。腺病毒是無包膜的線性雙鏈DNA病毒，在自然界廣泛分布，對人致病性小，不誘導癌變，較為安全，不整合入細胞基因組，遺傳毒性低，宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效率高，易于制備、純化[2]。并且，腺病毒因其宿主細胞廣，繁殖滴度高，裝載容量大，成為近年來病毒載體研究熱點[3]。直接將腺病毒載體導入人體內(nèi)表達目的基因，治療惡性腫瘤、心血管疾病或一些遺傳疾病已取得可喜進展[1]；利用腺病毒載體在包裝細胞293中表達分泌性蛋白質(zhì)，如蛋白酪氨酸激酶1C等亦成為生產(chǎn)重組蛋白的一條途徑。因此，完善293細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)及腺病毒擴增技術(shù)具有越來越重要的市場意義[4]。腺病毒的生產(chǎn)以細胞感染病毒為分水嶺可分為細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)2個階段， 細胞感染病毒后，病毒的釋放時機及收獲等的生產(chǎn)工藝參數(shù)一直是業(yè)內(nèi)關(guān)注的重點，而通過生產(chǎn)工藝的不斷改進降本增效也已成為業(yè)內(nèi)的共識。本研究主要探討在細胞感染病毒后，在培養(yǎng)液中繼續(xù)保持一定濃度的葡萄糖，從而達到提高單批次病毒生產(chǎn)產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

14 L CelliGen Plus生物反應(yīng)器、Disk載體（NBS公司）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；DMEM高、低糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；葡萄糖試劑盒（上海名典生物工程有限公司）；分光光度計（上海尤尼克儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 原生產(chǎn)工藝

采用CelliGen Plus的生物反應(yīng)器系統(tǒng)及Disk載體（兜籃式載體貼壁培養(yǎng)方式）培養(yǎng)293細胞，上罐細胞總量大1×109個細胞，于37 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量（混合氣體總量）0.4 L/min、工作體積10 L、含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量4.5 g/L）培養(yǎng)， 24 h后開始用含10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液灌注培養(yǎng)6～9 d（根據(jù)每批次的細胞狀態(tài)而定），當體系內(nèi)細胞量處于飽和狀態(tài)（根據(jù)糖耗值判斷），接入病毒感染活性濃度3.16×1011 TCID50/ml的腺病毒懸液50 ml。病毒感染8 h后恢復對培養(yǎng)體系的灌注，灌注用的培養(yǎng)液是含5%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，逐步降低灌注量，約48 h后采用含2% 胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量含量1 g/L）灌注培養(yǎng)，72 h后檢測體系內(nèi)病毒顆粒數(shù)，當反應(yīng)體系內(nèi)腺病毒濃度達到1×1010 vp/ml時，開始連續(xù)收獲系統(tǒng)內(nèi)的灌注打出液（病毒液），灌注體積（收獲量）是4 L/d，收獲約4 d左右，當反應(yīng)體系內(nèi)的用氧量回復到初始狀態(tài)（罐內(nèi)無細胞生長跡象）時，終止培養(yǎng)。

感染病毒后每24 h檢測系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量，發(fā)現(xiàn)在0～48 h內(nèi)，由于用高糖培養(yǎng)液灌注，系統(tǒng)內(nèi)殘?zhí)橇吭?.7 g/L左右，而48 h開始，用低糖培養(yǎng)液液灌注后，系統(tǒng)內(nèi)的殘?zhí)橇吭?.05 g/L，甚至更低，處于無糖狀態(tài)。

1.2.2 改進后生產(chǎn)工藝

細胞培養(yǎng)階段按1.2.1中的工藝操作，病毒感染后，每24 h取樣檢測系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量，48～120 h期間，仍然使用DMEM高糖培養(yǎng)液灌注，該段培養(yǎng)過程中，控制系統(tǒng)內(nèi)殘?zhí)窃?.3～1.0 g/L左右。在培養(yǎng)的后期（120 h開始）可采用含2%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量1 g/L）灌注培養(yǎng)，直至培養(yǎng)終止。

1.3 檢測方法

1）以培養(yǎng)過程中用氧量的比例（系統(tǒng)自帶自動測定）來對比改進前后培養(yǎng)體系內(nèi)相同時段內(nèi)細胞的生長趨勢。

2）用顆粒數(shù)檢測和病毒活性檢測（TCID50）來觀察改進后單批次病毒的產(chǎn)量及活性變化[5]。

2 結(jié)果

生物反應(yīng)器在滅菌后將通氣量設(shè)定在0.4 L/min。當將系統(tǒng)溶氧值設(shè)定在50%時，系統(tǒng)會利用外接的空氣、氧氣、氮氣自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)內(nèi)的溶氧狀態(tài)，使之達到設(shè)定的溶氧值（50%）。由于內(nèi)部沒有細胞生長，達到平衡后，此時三種氣體的用量占比（總流量是0.4 L/min）是固定值，正常情況下此時氧氣用量是0，由空氣和氮氣相互混合控制體系內(nèi)的溶氧值。當接種細胞后，隨著細胞生長耗氧，氮氣的用量逐步下降，遂開始用氧。由于系統(tǒng)內(nèi)除293細胞外，沒有其他生物體代謝耗氧，所以可通過氧氣用量占比判斷系統(tǒng)內(nèi)細胞生長情況。用氧占比高表明系統(tǒng)內(nèi)活細胞數(shù)量大；反之，系統(tǒng)內(nèi)活細胞數(shù)量少。

用改進后的方法連續(xù)生產(chǎn)7批次，收集每批次感染病毒后系統(tǒng)每天的用氧情況，取均值，與之前生產(chǎn)的11個批次對應(yīng)的數(shù)據(jù)比較（圖1）。

結(jié)果表明，改進后的工藝從第4天開始，用氧量的下降趨勢明顯小于改進前，并且用氧量回歸到系統(tǒng)生產(chǎn)前調(diào)試階段時初始值的時間平均比改進前延后了24 h，表明在之后相同的培養(yǎng)時段，改進后系統(tǒng)內(nèi)的活細胞數(shù)量多于改進前，并有延遲凋亡的跡象。

用改進后的方法連續(xù)生產(chǎn)7批次，與改進前生產(chǎn)的11個批次對比見表1。

改進后工藝生產(chǎn)的病毒顆粒數(shù)（產(chǎn)量）與改進前工藝相比有41.1%的提升，病毒活性比沒有太大變化，表明新工藝可提高單批次的病毒產(chǎn)量，對病毒的活性沒有影響。

3 分析與討論

3.1 原工藝設(shè)計思路

原工藝制定受產(chǎn)品研發(fā)階段的培養(yǎng)模式影響較大。

產(chǎn)品研發(fā)階段，使用培養(yǎng)皿小試生產(chǎn)腺病毒。293細胞生長時期，用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）培養(yǎng)，細胞利用葡萄糖作為碳源，代謝產(chǎn)物為乳酸。而在293細胞感染病毒后，如繼續(xù)使用DMEM高糖培養(yǎng)液，會造成細胞代謝旺盛，產(chǎn)生的酸性環(huán)境，從而導致病毒的衣殼發(fā)生裂解，對病毒的擴增及最終的活性起到負面作用[6]。

用以下兩個小實驗來了解293細胞糖代謝后的產(chǎn)酸情況及對病毒生產(chǎn)的影響。

1）在培養(yǎng)皿體系用DMEM高糖測試細胞生長后產(chǎn)酸結(jié)果：293細胞以1∶2傳代，72 h培養(yǎng)（未感染病毒），代謝后的培養(yǎng)液檢測，pH在6.85左右。

2） 對培養(yǎng)皿體系中的293細胞接入腺病毒時分別使用DMEM高糖（葡萄糖含量4.5 g/L）和DMEM低糖培養(yǎng)液（葡萄糖含量1 g/L），培養(yǎng)48 h以上，同時收獲，分別檢測pH、病毒顆粒數(shù)和活性（表2）。

表2所示，病毒培養(yǎng)階段使用高糖培養(yǎng)液的培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)酸較多，而用高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)對應(yīng)的病毒顆粒數(shù)和活性都較低，所以在當初工藝設(shè)計時，感染病毒后改用DMEM低糖培養(yǎng)，通過減少碳源量降低乳酸代謝產(chǎn)物，避免過酸環(huán)境影響到病毒的產(chǎn)量，該設(shè)計不僅用于培養(yǎng)皿制備腺病毒，后來也應(yīng)用于生物反應(yīng)器的大規(guī)模病毒生產(chǎn)。

3.2 原工藝設(shè)計的合理性和局限性

1） 合理性 在培養(yǎng)皿培養(yǎng)過程中，除了少量的氣體交換外，既沒有其他營養(yǎng)物質(zhì)的補充和交換，也沒有酸堿調(diào)節(jié)體系，減少碳源似乎是降低體系內(nèi)酸度的唯一方法。所以在一次性收獲的培養(yǎng)皿制備中具有一定的合理性（可避免細胞過度產(chǎn)酸影響病毒產(chǎn)量）。

2） 局限性 但利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)階段和病毒擴增階段都采用灌注培養(yǎng)方式（新鮮培養(yǎng)液pH在8.0～8.5間），并配有補堿（8%碳酸氫鈉溶液）系統(tǒng)，兩者都可以中和體系中（系統(tǒng)pH控制在7.0～7.4）的乳酸，所以這種設(shè)計意義不大，相反低糖環(huán)境易造成細胞低代謝水平會引起細胞過早凋亡，在連續(xù)收獲的反應(yīng)器體系中會影響病毒的產(chǎn)量。

3.3 討論

從上述數(shù)據(jù)對來看，在大規(guī)模灌注培養(yǎng)腺病毒的工藝中，感染病毒后0～120 h之間系統(tǒng)內(nèi)的含葡萄糖量（碳源）決定了這批次可有效用于腺病毒擴增的活細胞數(shù)量和生命狀態(tài)，而這些與最終腺病毒的產(chǎn)量有著直接關(guān)系。細胞感染病毒后直徑從15 mm增至17 mm。在感染8～48 h期間，細胞對葡萄糖的消耗以及乳酸的生成量均增加了30%～100%，氧氣的消耗和三磷酸腺苷的生成也有類似的趨勢。因此，在培養(yǎng)病毒階段更要注意營養(yǎng)物質(zhì)的適度補給，一方面及時補充葡萄糖，因為在病毒擴增過程中，一旦葡萄糖耗竭會導致病毒擴增的停止[7]。病毒從接入細胞培養(yǎng)系統(tǒng)后，要經(jīng)過入侵細胞、細胞內(nèi)復制（病毒蛋白外殼和病毒核酸）、細胞內(nèi)裝配和破裂宿主細胞等幾個階段，這個過程約48～72 h。如果在48～120 h內(nèi)灌注1 g/L的低糖培養(yǎng)液，低碳源的環(huán)境加速了細胞的凋亡，降低了細胞內(nèi)病毒復制、裝配的成功率；而在48～120 h內(nèi)依然灌注4.5 g/L的高糖培養(yǎng)液，改善系統(tǒng)內(nèi)細胞代謝條件，維持細胞的生長狀態(tài)，可為腺病毒的復制、裝配提供更多的時間和穩(wěn)定的宿主生長條件，從而提高病毒產(chǎn)量。

另外，CelliGen Plus生物反應(yīng)器系統(tǒng)的特點是啟動后，難以從系統(tǒng)中取樣計算細胞量（打開罐體將會破壞無菌生長環(huán)境），因而培養(yǎng)過程中采用檢測系統(tǒng)內(nèi)葡萄糖含量值來判斷細胞生長情況。盡管病毒感染時，病毒細胞數(shù)比值即感染復數(shù)（MOI）按1∶20估算，實際情況下仍有大量正常細胞未被感染[8-9]，所以感染病毒后繼續(xù)保持系統(tǒng)內(nèi)的含糖量有利于維持過量的細胞的狀態(tài)，利用病毒的二次感染也是提高批次病毒產(chǎn)量的途徑之一。

為了在病毒感染后對系統(tǒng)內(nèi)的殘?zhí)强刂圃?.3～1 g/L的范圍內(nèi)，除了改用高糖培養(yǎng)液外，還在某些時段增加了灌注量，這也就相應(yīng)增加了一些收獲液的體積，從而增加了后期純化的工作量，可考慮使用更高糖濃度的培養(yǎng)液或單獨補糖來解決。

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