亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與糖尿病微血管病變關(guān)系的研究

孫蔚雯,王 立

(1. 北京華信醫(yī)院，北京 100016；2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院，北京 100053)

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是參與Hcy代謝的非常重要的物質(zhì)，編碼這個(gè)酶的第677位堿基對(duì)C到T突變，可能導(dǎo)致同型半胱氨酸(Hcy)水平升高。而Hcy升高可以導(dǎo)致動(dòng)脈硬化，從而引發(fā)心、腎、腦等多種臟器的血管性疾病。糖尿病腎病(DN)和糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)同為糖尿病微血管病變，本研究擬通過(guò)分析這兩種疾病的MTHFR基因多態(tài)性及血漿Hcy水平等指標(biāo)，來(lái)探討糖尿病微血管病變發(fā)生的相關(guān)因素。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇2013年1月—2017年1月于北京華信醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院住院的2型糖尿病患者417例，均符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)：糖尿病癥狀+任意時(shí)間血漿葡萄糖水平≥11.1 mmol/L或空腹血漿葡萄糖水平≥7.0 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)中，2 h血糖水平≥11.1 mmol/L。無(wú)糖尿病癥狀者，需另日重復(fù)測(cè)定血糖以明確診斷。患者年齡≥50歲，病程≥5年。1年內(nèi)未口服葉酸。根據(jù)DN的情況分組,DN組[尿白蛋白排泄率(UAER)≥20 μg/min，排除發(fā)熱、泌尿系感染、腎炎、腎病綜合征、充血性心衰及其他應(yīng)激狀態(tài)、劇烈運(yùn)動(dòng)等因素導(dǎo)致的UAER升高]共90例，男51例，女39例；年齡(62.58±7.95)歲；病程(14.57±6.49)年。非DN(NDN)組(UAER<20 μg/min)共327例，男172例，女155例；年齡(62.76±8.61)歲；病程(14.26±6.64)年。再根據(jù)患者DR情況分組，DR組(眼底檢查見(jiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變，眼底檢查需散瞳后由專(zhuān)職眼科醫(yī)師進(jìn)行)共176例，男91例，女85例；年齡(62.38±8.15)歲；病程(16.36±6.74)年。非DR(NDR)組(眼底檢查發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變)共241例，男131例，女110例；年齡(62.95±8.71)歲；病程(12.82±6.10)年。

1.2方法

1.2.1測(cè)定身高、體質(zhì)量 清晨空腹解大小便后穿輕薄衣服測(cè)量體質(zhì)量，脫鞋后直立測(cè)量身高。計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高(m2)。

1.2.2相關(guān)生化指標(biāo)的測(cè)定 所有入組的患者于入院次日清晨空腹經(jīng)肘靜脈采血測(cè)Hcy、空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、相關(guān)肝腎功能指標(biāo)、葉酸、糖化白蛋白，相關(guān)血脂指標(biāo)包括三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)。留取12 h尿，行12 h尿微量白蛋白檢測(cè)。

1.2.3測(cè)定MTHFR基因型 首先用細(xì)胞裂解方法從外周血細(xì)胞中將基因組DNA提取出來(lái)；然后用MTHFR基因特異引物經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，將帶生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在醛基基片上的MTHFR基因型檢測(cè)探針進(jìn)行特異雜交反應(yīng)，并通過(guò)酶促顯色反應(yīng)，使特異性雜交信號(hào)呈現(xiàn)出顏色；通過(guò)對(duì)芯片進(jìn)行掃描，得到樣品DNA與MTHFR(C677T)基因位點(diǎn)的野生型和突變型探針雜交形成的雜交圖像；經(jīng)過(guò)軟件分析該圖像，判斷待檢樣品的基因型。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料及生化指標(biāo)比較

2.1.1DN組和NDN組 DN組TG明顯高于NDN組(P<0.05)，而2組年齡、病程、BMI及HbA1c、糖化白蛋白、葉酸、FPG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 DN組和NDN組一般情況和生化指標(biāo)比較

注：①與NDN組比較，P<0.05。

2.1.2DR組和NDR組 DR患者病程明顯長(zhǎng)于NDR組(P<0.05)，TG、葉酸水平均顯著高于NDR組(P均<0.05)，2組年齡、BMI、HbA1c、糖化白蛋白、FPG、TC、HDL-C及LDL-C水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2各組間MTHFR基因型和等位基因頻率比較

2.2.1DN組和NDN組 2組MTHFR基因型CC型、CT型、TT型的患者比例差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)， C等位基因和T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表3。

表2 DR組和NDR組一般情況及生化指標(biāo)比較

注：①與NDR組比較，P<0.05。

表3 DN組和NDN組MTHFR基因型和等位基因分布頻率

2.2.2DR組和NDR組 2組MTHFR基因型CC型、CT型、TT型所占比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，C等位基因和T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表4。

表4 DR組和NDR組MTHFR基因型和等位基因分布頻率

2.3各組MTHFR各基因型血漿Hcy水平比較

2.3.1DN組、NDN組 DN組血漿Hcy水平顯著高于NDN組(P<0.05)。所有患者中，MTHFR基因CT型患者與CC型患者血漿Hcy水平相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TT型患者血漿Hcy明顯高于CC型和CT型(P均<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 DN組、NDN組各基因型血漿Hcy水平比較

注：①與NDN組比較，P<0.05；②與TT型比較，P<0.05。

2.3.2DR組、NDR組 2組血漿Hcy水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表6。

2.4DN和DR危險(xiǎn)因素分析

2.4.1DN危險(xiǎn)因素分析 以有無(wú)DN為因變量，以MTHFR基因型、性別、年齡、病程、是否患高血壓、BMI、HbA1c、葉酸、FPG、TC、HDL-C、LDL-C、糖化白蛋白、Hcy為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示性別、病程、BMI、TC、LDL-C與DN的發(fā)生有關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)表7。

表6 DR組、NDR組各基因型血漿Hcy水平比較

表7 DN危險(xiǎn)因素分析

根據(jù)上表得出回歸方程為：logitP=-0.539X1+0.086X2+0.084X3+0.768X4-0.641X5-5.783，方程2=39.70,P<0.001,回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中X1代表性別(男=1，女=2)，X2代表病程，X3代表BMI，X4代表TC，X5代表LDL-C。

2.4.2DR危險(xiǎn)因素分析 以有無(wú)DR為因變量，以MTHFR基因型、性別、年齡、病程、是否患高血壓、BMI、HbA1c、葉酸、FPG、TG、TC、HDL-C、LDL-C、糖化白蛋白、Hcy為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示病程、TG和Hcy與DR發(fā)生有關(guān)。見(jiàn)表8。

表8 DR危險(xiǎn)因素分析

根據(jù)上表得出回歸方程為：logitP=0.108X1+0.174X2+0.05X3-0.438，方程2=47.57,P<0.001,回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中X1代表病程，X2代表TG，X3代表Hcy。

2.5血漿Hcy水平與2型糖尿病微血管病變關(guān)系高Hcy血癥組DN患病率為33.9%，明顯高于Hcy水平正常組的19.7%。高Hcy血癥組DR患病率為53.6%，明顯高于Hcy水平正常組的40.4%。

3 討 論

DN的發(fā)病受多方面因素的影響。1型及2型糖尿病發(fā)生DN受家族及種族的遺傳傾向[1]，許多基因與DN有關(guān)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因[2]、白細(xì)胞介素-6基因、醛糖還原酶(AR)基因[2]均與DN的發(fā)生關(guān)系密切，且表現(xiàn)為多基因及環(huán)境的影響。有國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究顯示，MTHFR基因多態(tài)性與DN的發(fā)生有關(guān)，機(jī)制為MTHFR基因第677位堿基對(duì)C突變?yōu)門(mén)，致該酶活性下降，從而導(dǎo)致血漿Hcy水平升高，造成血管損傷進(jìn)而促進(jìn)DN的發(fā)生。曾有對(duì)9篇國(guó)內(nèi)近年來(lái)有關(guān)MTHFR基因C677T突變的文獻(xiàn)中健康人群基因多態(tài)性的匯總分析顯示，CC型的基因型頻率為38.9%，CT型為43.5%，TT型為17.6%，C等位基因頻率為41.2%，T等位基因頻率為58.8%[3]。

研究表明，DN、DR患者M(jìn)THFR基因的T等位基因頻率高于健康人群及普通2型糖尿病患者，考慮MTHFR基因C677T突變?yōu)榇藘煞N糖尿病微血管病變的危險(xiǎn)因素[4]。本研究結(jié)果顯示，DN組和NDN組MTHFR基因型CC型、CT型、TT型患者比例及C等位基因和T等位基因頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DR組和NDR組基因型CC型、CT型、TT型患者比例及C等位基因和T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明糖尿病微血管病變的發(fā)生可能與MTHFR基因第677位堿基C-T突變產(chǎn)生的基因多態(tài)性無(wú)關(guān)。

血漿Hcy水平受到許多其他因素的影響，男性Hcy水平通常高于女性。葉酸、維生素B12、維生素B6等可以降低Hcy水平，吸煙可以使血漿Hcy水平升高[5]。某些藥物如二甲雙胍也可以使血漿Hcy水平升高，可能由于它影響葉酸、維生素B12的吸收所致。有研究表明，2型糖尿病患者血漿Hcy與體現(xiàn)胰島素抵抗的指標(biāo)BMI和反映血糖代謝的指標(biāo)FPG、2 hPG、HbA1c均呈正相關(guān)，說(shuō)明糖尿病患者的血漿Hcy水平升高可能與胰島素抵抗程度和血糖控制水平有關(guān)[6]。本研究結(jié)果顯示，CT型患者與CC型患者血漿Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TT型患者血漿Hcy明顯高于CC型和CT型，提示MTHFR基因型影響血漿Hcy水平。

Hcy可以導(dǎo)致動(dòng)脈硬化性改變，從而影響糖尿病大血管及微血管病變的發(fā)生。國(guó)內(nèi)外研究表明，血漿Hcy水平升高是發(fā)生糖尿病微血管病變的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，DN患者血漿Hcy水平顯著高于NDN患者，提示血漿Hcy水平可能與NDN有關(guān)，而DR患者血漿Hcy水平與NDR患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圍繞DR危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析中，Hcy對(duì)視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有影響，為危險(xiǎn)因素之一。進(jìn)一步分析顯示，高Hcy血癥組DN患病率和DR患病率明顯高于Hcy水平正常組。表明血漿Hcy可能是2型糖尿病微血管病變的危險(xiǎn)因素，與以往研究結(jié)果一致。

本研究Logistic回歸顯示，病程為DR的危險(xiǎn)因素。代謝性因素如BMI、向心性肥胖等因素可引起胰島素抵抗及血管內(nèi)皮炎癥，從而導(dǎo)致或加重視網(wǎng)膜病變。本研究中，BMI與DN的發(fā)生相關(guān)，與以往研究一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，TG可能是DN和DR共同的危險(xiǎn)因素。對(duì)于DN，Logistic回歸分析顯示TC為其危險(xiǎn)因素，而LDL-C為保護(hù)性因素，女性的患病風(fēng)險(xiǎn)較男性低。有研究顯示，LDL-C為糖尿病微血管病變的危險(xiǎn)因素，考慮本研究結(jié)果可能受患者服用他汀等降脂藥物的影響有關(guān)[7]。

總之，DN組、NDN組以及DR組、NDR組，MTHFR基因CC型、CT型、TT型所占比例及C和T等位基因頻率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明MTHFR基因多態(tài)性可能與糖尿病微血管病變無(wú)關(guān)。DN組血漿Hcy水平高于NDN組，DR組和NDR組血漿Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但Logistic回歸顯示Hcy升高與DR發(fā)生有關(guān)，故血漿Hcy水平可能與糖尿病微血管病變有關(guān)。