Nrf2、Keap1蛋白在104例肺腺癌中的表達及其臨床病理特征

肖宇 朱翔 顧陽春 陳森 梁莉 曹寶山

肺癌目前是世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其中80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），約75%的NSCLC就診時已屬于中晚期[2,3]。肺腺癌是NSCLC中最常見的一種病理類型，發(fā)現(xiàn)時亦多處于中晚期，藥物治療仍是其主要的治療手段。盡管近年來隨著對表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因功能的深入認識，EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）給EGFR突變肺腺癌帶來了生存和生活質量的顯著改善[4-7]，但不論是化療，還是EGFR-TKIs，耐藥仍是臨床上亟待解決的問題。因此，探索藥物療效預測相關的分子指標是目前研究熱點之一，這將有助于提高藥物療效、降低藥物毒性，改善患者生活質量、減輕患者經濟和心理壓力。

核因子E2相關因子2［nuclear factor-erythroid 2(NF-E2) p45-related factor 2, Nrf2］/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1）是細胞應對氧化應激和親電性應激損傷的重要防御通路[8,9]。生理狀況下，Keap1結合Nrf2，并與E3泛素化連接酶結合，通過泛素化介導Nrf2蛋白降解，維持細胞漿內Nrf2較低水平。一旦細胞處于氧化應激或親電應激狀態(tài)，Keap1成為敏感的傳感器，通過對自身半胱氨酸殘基的修飾，阻止Nrf2降解，并促進Nrf2釋放。累積的Nrf2進入細胞核內，激活抗氧化反應元件（antioxidant response element, ARE），進而激活ARE驅動的II相藥物代謝酶和抗氧化基因以及部分III相藥物轉運蛋白表達，從而保護細胞免受氧化應激或親電應激損傷[8,9]。Nrf2/Keap1信號的異常激活不但參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉移[10-12]，而且還影響化療藥物[9,12,13]和EGFR-TKIs的療效[14,15]，Krall等在含有驅動基因的肺腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)Keap1功能缺失會導致多種靶向藥物耐藥[16]。我們前期研究表明Keap1高表達者鉑類藥的療效會減低[17]，EGFR突變患者中Nrf2高表達者EGFR-TKIs的療效也出現(xiàn)降低[14]。因此，Nrf2/Keap1通路已成為肺癌預防和治療的潛在靶點[18]，但Nrf2、Keap1在不同驅動基因肺腺癌患者中的表達情況和對相應治療的影響，尚缺乏此方面報道。

本研究回顧性分析了2010年6月-2012年12月在北京大學第三醫(yī)院接受過EGFR基因突變檢測的肺腺癌患者104例，通過免疫組化方法，確定Nrf2、Keap1在EGFR突變型和野生型肺癌患者中的表達情況及其臨床病理特征，并分析Nrf2、Keap1表達水平對EGFR-TKIs療效的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2010年6月-2012年12月在北京大學第三醫(yī)院接受過EGFR基因突變檢測［通過擴增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system, ARMS）或直接測序法］的肺癌患者。入組標準：組織學病理確診為肺腺癌；具有明確的EGFR基因檢測結果；有完善的影像學檢查［胸腹部計算機斷層掃描（computed tomography,CT）、頭顱磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）］可供腫瘤分期評價；有足夠的組織標本可供免疫組化檢測；預計生存期超過3個月的患者。排除標準：組織學病理非肺腺癌者（如鱗癌、大細胞癌、小細胞癌等）；缺乏足夠的組織標本供免疫組化檢測；治療前分期評價不足的。

1.2 臨床資料收集 采集并記錄患者確診時的臨床資料，包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、病理亞型、分化程度、EGFR基因突變結果和EGFR-TKIs治療期間的影像學資料。

1.3 腫瘤分期及病理亞型診斷標準 腫瘤分期依據國際肺癌研究協(xié)會頒布的第7版分期標準[19]，肺腺癌病理亞型診斷依據國際肺癌研究協(xié)會/美國胸科學會/歐洲呼吸學會2011年頒布的關于肺腺癌的國際多學科新分類標準[20]。

1.4 遠期療效評價標準 遠期療效包括無疾病進展生存期（progression free survival, PFS）和總生存期（overall survival, OS）。PFS定義為從初次治療開始至疾病進展或任何原因導致死亡的時間，OS定義為從初次治療開始至死亡或隨訪終點時間。

1.5 隨訪 接受EGFR-TKIs治療的患者通過定期來院或電話隨訪，隨訪開始時間為2010年7月，末次隨訪時間為2017年12月，最短隨訪時間3個月，最長75個月。

1.6 免疫組化檢測Nrf2、Keap1蛋白表達

1.6.1 實驗方法 手術切除的組織標本或活檢組織標本經10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片，4 μm厚度。免疫組化采用SP法［兔抗人Nrf2抗體（ab31163）購于Abacm?公司，兔抗人Keap1抗體購于Proteintech?公司，對應的免疫組化二抗SP檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，Nrf2及Keap1抗體均按1:100稀釋］，應用PBS代替一抗作為陰性對照，按照試劑說明書進行操作。

1.6.2 結果判定 采用單盲法閱片（病理醫(yī)師不清楚臨床資料），Nrf2抗原陽性反應可位于細胞漿和細胞核中，Keap1抗原陽性反應位于細胞漿內。參照Solis等[21]及曹寶山等[14,17]前期研究結果，將細胞核染色強度和細胞核陽性比例乘積＞0定義為Nrf2陽性，反之為陰性；將評分＞100%，定義為Nrf2高表達，反之為低/不表達。將細胞染色強度和陽性細胞比例乘積＜150%定義為Keap1低/不表達，反之為高表達。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件分析。率的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗；相關性檢驗采用Pearson檢驗；非參數(shù)檢驗采用Wilcoxon秩和檢驗，應用Kaplan-Meier方法進行生存分析，Log-rank檢驗差異性；多因素分析采用Cox多因素分析模型，逐步后退法（backward, walds）。全部統(tǒng)計檢驗均為雙側概率檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床特征 符合入組條件的肺腺癌患者共104例，其中男性57例，女性47例，中位年齡為66歲（21歲-84歲），≥70歲者44例，＜70歲者60例；III期和IV期患者共74例（71.1%）；中低分化者84例（80.8%）。腺泡型、實體型和貼壁型是本研究中最常見的病理亞型，分別為49例（47.1%）、22例（21.2%）及19例（18.3%）。本組患者中EGFR突變率為67.3%（70/104），其中外顯子19缺失突變（19del）45例，外顯子21 L858R點突變21例，其他突變4例（分別為外顯子18 G719A和G724S突變各1例，外顯子20 L815P和Y801C突變各1例），見表1。相關分析表明，EGFR突變與腫瘤分期（r=0.176,P=0.073）及吸煙（r=-0.191,P=0.051）有一定相關趨勢，但與年齡（r=0.057,P=0.562）、性別（r=0.139,P=0.161）、病理亞型（r=0.080,P=0.418）和病理分化程度（r=-0.097,P=0.328）等無相關。

2.2 Nrf2表達水平及其與患者臨床特征間的關系 Nrf2表達在細胞核和細胞漿中均可以表達，且存在個體差異，與曹寶山等前期研究[14]一致。本組Nrf2陽性率為71.2%（74/104），Nrf2陽性水平在性別、分期和EGFR突變狀態(tài)等組內存在顯著差異（P＜0.05）。EGFR突變組中Nrf2陽性率為80.4%，顯著高于EGFR野生型組Nrf2陽性率的50%（P=0.001）；女性患者中Nrf2陽性率為80.9%，顯著高于男性組的63.2%（P=0.047）；分期越晚Nrf2陽性率越高（P=0.044）。但Nrf2表達水平在年齡、吸煙、腫瘤分化程度、病理亞型等組內無顯著差異（P＞0.05），見表2。Nrf2陽性率在19del和21L858R突變患者中分別為80.0%（36/45）和90.5%（19/21），二者無顯著差異（P=0.287）。

2.3 Keap1表達水平及其與患者臨床特征間的關系 Keap1主要表達在細胞漿中，與曹寶山等前期研究結果[17]一致。本組Keap1高表達率為34.6%（36/104）。Keap1表達水平與腫瘤分期有一定相關趨勢，但在年齡、性別、吸煙、病理亞型、分化程度、EGFR突變狀態(tài)等組內無顯著差異（P＞0.05），見表3。

2.4 Nrf2表達水平及其與EGFR-TKIs治療患者臨床特征間的關系 本研究中38例患者接受了EGFR-TKIs治療，無EGFR基因突變者2例，資料不全者6例，30例EGFR突變接受EGFR-TKIs治療且資料齊全。30例患者中，17例為吉非替尼，6例為厄洛替尼，7例為埃克替尼；Nrf2陽性率為86.7%（26/30），Nrf2高表達率為40.0%（12/30）。Nrf2的高表達率與性別有關，女性組為63.2%（12/19），顯著高于男性組的0（0/11）（P=0.001），但在年齡、吸煙、腫瘤分化、腫瘤分期和EGFR突變類型等組內無顯著差異（P＞0.05），見表4。

2.5 生存分析 30例EGFR-TKIs治療的患者中，相關分析表明PFS與Nrf2高表達呈負相關（r=-0.527,P=0.003），而與年齡、性別、吸煙、腫瘤分化、腫瘤分期、Keap1表達水平等無關（P＞0.05）。Nrf2高表達組患者的PFS顯著低于不/低表達組，分別為（4.6±2.9）個月和（20.2±16.1）個月（P=0.003）。Kaplan-Meier生存分析表明：①Nrf2陽性組和陰性組間的OS無顯著差異，中位OS分別為24.0個月（95%CI: 15.3-32.7）和50.0個月（95%CI: 0.0-106.9）（P=0.861），圖1A。②Keap1高表達組和不/低表達組間的OS無顯著差異，中位OS分別為23.0個月（95%CI:16.6-29.4）和50.0個月（95%CI: 0.0-101.5）（P=0.801），圖1B。③Nrf2高表達組的OS顯著低于不/低表達/組，中位OS分別為15.0個月（95%CI: 10.0-20.0）和60.0個月（95%CI: 44.8-75.2）（P=0.001），圖1C。④患者OS與EGFR突變類型無關。19del、21L858R和罕見突變組的中位OS分別50.0個月（95%CI: 3.5-96.5）、20.0個月（95%CI:6.0-34.0）和3.0個月（P=0.695），圖1D。⑤患者的OS與分期無關，IIIb期和IV期兩組的中位OS分別為60.0個月（95%CI: 4.3-115.7）和24.0個月（95%CI: 13.0-35.0）（P=0.604），圖1E。

2.6Cox回歸分析 在校對患者EGFR基因突變狀態(tài)、Keap1表達水平、分期、性別和Nrf2高表達等因素后，多因素分析表明Nrf2高表達是EGFR-TKIs PFS（P=0.002）和OS（P=0.009）的獨立預測因素。Keap1表達水平對PFS和OS無顯著預測價值（P＞0.05），見表5。

表 1 104例肺腺癌患者臨床病理特征Tab 1 Clinicopathologic characteristics of 104 lung adenocarcinoma cases

3 討論

肺腺癌目前是NSCLC中最常見的病理類型，已發(fā)現(xiàn)EGFR、ALK、ROS1等多種驅動基因[22]，其中EGFR在亞裔患者中是最常見的一種[6,7,22]。本研究中EGFR突變率67.3%（70/104)，19del和21L858R突變占整體突變的94.3%，EGFR突變傾向于發(fā)生在分期晚和不吸煙的患者中，與既往研究結果類似[4,6,7]；但本研究中EGFR突變的發(fā)生與性別和病理亞型無關，且19del突變顯著多于21L858R突變，與前期研究結果不同[23]。產生差異的原因在于病例非連續(xù)入組，存在選擇偏倚。EGFR-TKIs是進展期EGFR基因敏感突變患者一線治療的首選藥物，但耐藥仍是臨床面臨的難題。Nrf2/Keap1通路是細胞應對氧化應激和親電性應激損傷的重要防御通路，Nrf2、Keap1在肺癌中與藥物耐藥和腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移密切相關。曹寶山等前期研究表明Nrf2/Keap1通路與肺癌化療和靶向治療療效有關，其中Keap1高表達會降低鉑類藥物療效[17]，而Nrf2高表達會減低EGFR-TKIs的療效[14]。近期Krall等發(fā)現(xiàn)Keap1功能缺失會導致EGFR-TKIs耐藥[16]。但Nrf2和Keap1的表達水平與EGFR基因突變狀態(tài)是否相關，且Keap1的表達水平是否會影響EGFR-TKIs的療效，目前缺乏此方面的臨床研究。

本研究通過免疫組化方法檢測104例肺腺癌患者，結果發(fā)現(xiàn)Nrf2陽性率為71.2%，其中在EGFR基因突變組Nrf2陽性率為80.4%，顯著高于EGFR基因野生型組的50.0%（P=0.001），但Nrf2陽性率在19del和21L858R兩突變組間無顯著差別（P＞0.05）。在EGFR基因突變組中Nrf2陽性率與前期小樣本研究結果類似（77.4%）[14]，但遠高于Solis等[21]報道的26.0%的陽性率。本研究還發(fā)現(xiàn)Nrf2陽性率與分期有關，分期越晚Nrf2陽性率越高（P=0.044），與朱翔等研究結果[14]類似。本研究結果與Solis等[21]產生差異的原因為：①Solis等[21]研究的患者以早期為主，晚期患者數(shù)量不足1/4；②Yamadori等[15]研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號活化可上調Nrf2表達水平，因此在EGFR敏感基因突變患者中，EGFR通路活化是導致Nrf2陽性表達率增高原因之一；③Solis等[21]報道的23例EGFR基因突變患者中無Nrf2陽性表達，此種差異或許與腫瘤分期、種族等因素有關。本研究中Keap1高表達率為34.6%（36/104），高于前期研究中的26.0%（13/50）[17]，Keap1的表達水平與腫瘤分期有一定相關趨勢，但與EGFR突變狀態(tài)無關。與前期研究產生差異的原因或許在于前期研究中含有40%鱗癌患者及樣本量較小[17]。上述結果可通過前瞻性研究得到進一步的驗證。

表 2 Nrf2陽性率同肺腺癌患者臨床特征間的關系Tab 2 Relationship between positive Nrf2 and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients

本研究在含有EGFR基因突變并且接受EGFR-TKIs治療的患者中發(fā)現(xiàn)：EGFR-TKIs的療效與Nrf2表達水平顯著相關，Nrf2高表達組的PFS和OS顯著低于Nrf2不/低表達組，多因素分析表明Nrf2表達水平是EGFR-TKIs治療患者PFS和OS的獨立預后因素。這與朱翔等研究結果相一致[14]，且與Yamadori等[15]在含有EGFR基因敏感突變的細胞株中發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象一致，即Nrf2激活會導致EGFR-TKIs耐藥。這或許是因為：Nrf2一旦激活，其進入細胞核中，進而激活ARE調控的藥物解毒酶和代謝酶，從而促進細胞增殖、抑制細胞凋亡[9,24]。但在本研究中，患者的PFS和OS與EGFR基因不同突變位點無關，這與Jackman等[25]研究結果不同，即外顯子19del突變人群的OS優(yōu)于21858R突變的人群?？赡芘c本研究樣本量小有關。

表 3 Keap1陽性率同肺腺癌患者臨床特征間的關系Tab 3 Relationship between Keap1 expression and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients

圖 1 EGFR-TKIs治療患者總生存期在不同組間的變化。A：Nrf2陽性組和陰性組患者的中位OS無顯著差異；B：Keap1高表達組和不/低表達組患者的中位OS無顯著差異；C：Nrf2高表達組中位OS顯著低于不/低表達組；D：EGFR基因不同突變組的中位OS無顯著差異；E：IIIb期和IV期患者的中位OS無顯著差異。Fig 1 Overall survival (OS) of patients treated by EGFR-TKIs in different groups.A: The median OS of lung adenocarcinoma patients between Nrf2 positive group and Nrf2 negative group were similar； B: The median OS of lung adenocarcinoma patients between Keap1 high expression group and Keap1 low/negative expression group were similar； C: The median OS of lung adenocarcinoma patients of Nrf2 high expression group was significantly lower than that of Nrf2 low/negative group； D: The median OS of lung adenocarcinoma patients among different EGFR mutation groups were not significantly different； E: The median OS of lung adenocarcinoma patients between stage IIIb and stage IV were similar.

表 4 Nrf2高表達率同接受EGFR-TKIs治療肺腺癌患者臨床特征間的關系Tab 4 Relationship between Nrf2 nuclear high expression and clinicopathologic characteristics of lung adenocarcinoma patients treated by EGFR-TKIs

表 5 多因素分析EGFR-TKIs特異性生存的預后因素(n=30)Tab 5 Cox regression analysis of the disease-specific survival with EGFR TKIs (n=30)

本研究Keap1高表達組與不/低表達組的兩組患者在PFS和OS均無顯著差異，提示Keap1表達水平或許與EGFR-TKIs療效無關。但Krall等[16]發(fā)現(xiàn)Keap1功能消失會激活Nrf2，進而導致厄洛替尼的耐藥[16]。兩項研究結果之間產生差異的原因在于：①Keap1是細胞內環(huán)境敏感的傳感器，Keap1表達情況隨著外界環(huán)境刺激發(fā)生改變[9]，其真正發(fā)揮作用具有一定滯后性；②Krall等[16]研究利用的基因敲除技術，使得Keap1功能真正消失，而本研究中Keap1的表達水平并不能代表Keap1基因的功能。因此，Keap1對EGFR-TKIs療效的影響進一步需要在基因水平進行驗證。

本研究通過回顧性研究分析，發(fā)現(xiàn)Nrf2陽性率在EGFR基因突變的患者顯著升高，Nrf2高表達者EGFRTKIs的PFS和OS差，多因素分析表明Nrf2表達水平是EGFR-TKIs PFS和OS的獨立預測因子，但Keap1表達水平與EGFR基因突變狀態(tài)及EGFR-TKIs療效無關。綜上可見，Nrf2在含有EGFR突變患者中或許是預測EGFR-TKIs療效理想的分子指標，還是提高EGFR-TKIs療效潛在的干預靶點。需要進一步擴大樣本量進行前瞻性研究，驗證Nrf2和Keap1的臨床價值，并通過基因檢測明確其具體機制。