桑果發(fā)育期生物活性物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的變化

劉和平，張廣明，胡會剛，黃新良，楊轉(zhuǎn)英

（1.陽江職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與環(huán)境工程系，廣東陽江 529566）(2.茂名市水果科學(xué)研究所，廣東茂名，525000)(3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江 524091)(4.廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江 524088）

桑果，為?？浦参锏墓?，每年4～6月為其采摘期?！侗静菥V目》等多種醫(yī)藥典籍記載，桑果性味甘寒，具有補肝益腎、生津潤燥、烏發(fā)明目等功效。此外，桑果還含有豐富的維生素和 Fe、Ca等礦物質(zhì)元素及人體必需的18種氨基酸、果膠、無機(jī)鹽類和紫紅色色素等，其各種營養(yǎng)成分高于常見水果[1]。近年來，國內(nèi)外研究人員針對桑果中生物活性物質(zhì)及其功效開展了相關(guān)研究，陳誠等[2]指出桑果的主要活性物質(zhì)包括花色苷、白藜蘆醇、蘆丁、多糖等，具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗氧化、保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、抗癌等多種藥理活性。黃勇等[3]研究表明桑果中多種活性成分具有調(diào)整機(jī)體免疫功能，促進(jìn)造血細(xì)胞的生長、降糖、降脂、降血壓等作用。現(xiàn)已被證實的生物活性物質(zhì)主要包括糖類、氨基酸、維生素、酶類、胡蘿卜素、酮和酚等11類，均具有抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等多種作用。本研究測定了不同樹齡、不同采收時期桑果果肉總酚、總黃酮、酚酸、單寧、葉綠素及類胡蘿卜素、花色素苷的含量、總抗氧化能力及超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、過氧化物酶（POD）活性、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性、苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性等，進(jìn)一步分析了桑果發(fā)育過程中生物活性物質(zhì)及抗氧化酶活性的變化規(guī)律，為開發(fā)桑果保健功能提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桑葚樹栽種于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所優(yōu)稀資源圃，選取3齡桑葚樹和5齡樹桑葚樹各5棵，分別于花后5 d、10 d、15 d和25 d（5 d～10 d為膨大期、10 d～15 d為轉(zhuǎn)紅期、15 d～25 d為成熟期）采樣，-40 ℃保存待測。

1.2 試驗方法

1.2.1 生物活性物質(zhì)含量的測定方法

總酚含量測定參考蔡文國等[4]的方法，用每克鮮重樣品含多少毫克當(dāng)量沒食子酸（GAW mg/g·FW）表示?？傸S酮含量測定參考游新俠等[5]的方法，用每克鮮重樣品含多少毫克當(dāng)量蘆?。≧E mg/g·FW）表示。酚酸含量測定采用三氯化鐵–鐵氰化鉀比色法[6]，以每克鮮重樣品含多少毫克當(dāng)量沒食子酸（GAE mg/g·FW）表示。單寧含量測定參考李學(xué)強(qiáng)等[7]的方法。葉綠素及類胡蘿卜素含量測定采用乙醇浸泡法，利用 Arnon公式計算出桑果葉綠素和類胡蘿卜素含量?；ㄉ剀蘸繙y定參照Wrolstad等[8]采用pH差示法?？扇苄蕴呛繙y定采用蒽酮比色法。

1.2.2 總抗氧化能力及抗氧化酶活性的測定方法

總抗氧化能力測定采用氧化還原法，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定參照Giannopolitis和Ries等[9]的方法，略有修改，酶活性單位采用抑制氮藍(lán)四唑（NBT）光化還原50%為一個酶活性單位。過氧化氫酶（CAT）活性測定參照曾韶西等[10]的方法，略有修改，以O(shè)D240每分鐘減少 0.1為一個酶活性單位（U）。過氧化物酶（POD）活性測定參照 Macadam 等[11]的方法，以每克果肉每分鐘OD470變化0.01為一個酶活單位（U），以酶的比活力（0.01 △OD/g·FW·min）表示其活性變化?？箟难徇^氧化物酶（APX）活性測定參照Nakano等[12]的方法，以O(shè)D290每分鐘下降0.01為1個酶活力單位（U），酶的活性以U/g·FW表示。苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性測定參照Wang等[13]的方法，以O(shè)D290變化0.01為一個酶活單位。

2 結(jié)果與討論

2.1 桑果發(fā)育期果肉生物活性物質(zhì)的變化

2.1.1 總酚含量的變化

由圖1可以看出，隨著果實的發(fā)育，3齡樹和5齡樹桑果果肉總酚含量均呈增長趨勢。膨大期和轉(zhuǎn)紅期的增長速率較慢，3齡樹果肉總酚含量從 0.49 mg/g·FW增長到1.03 mg/g·FW，增長了2.09倍，5齡樹則從0.58 mg/g·FW增長到1.02 mg/g·FW，增長了1.75倍。進(jìn)入成熟期，增長速率加快，3齡樹果肉總酚含量從1.03 mg/g·FW增長到2.99 mg/g·FW，增長了 2.89倍，5齡樹則從 1.02 mg/g·FW 增長到 3.36 mg/g·FW，增長了3.28倍。在整個發(fā)育過程中，5齡樹與3齡樹桑果果肉的總酚增長速率比較接近，但5齡樹各階段總酚含量一直略高于3齡樹。結(jié)果表明，隨著果實的發(fā)育，桑果果肉中總酚在成熟期合成速率最快，樹齡大的桑果總酚合成能力強(qiáng)。與殷浩[14]等的研究結(jié)果相似。

2.1.2 總黃酮含量的變化

圖2 桑果發(fā)育期果肉總黃酮含量的變化Fig.2 The changes of total flavone contents in mulberry fruit with its development

由圖2可以看出，桑果在發(fā)育過程中果肉總黃酮含量呈增長趨勢，但不同發(fā)育期增長速率不同。膨大期和轉(zhuǎn)紅期增長速率慢，3齡樹果肉總黃酮含量從0.68 RE mg/g·FW增長到1.43 RE mg/g·FW，增長了2.11倍，5齡樹則從 0.58 RE mg/g·FW 增長到 1.43 RE mg/g·FW，增長了2.48倍。進(jìn)入成熟期，總黃酮含量的增長速率變大，3齡樹果肉總黃酮含量從 1.43 RE mg/g·FW增長到了5.07 RE mg/g·FW，增長了3.53倍，5齡樹則從 1.54 RE mg/g·FW 增長到了 4.34 RE mg/g·FW，增長了2.81倍?；ê?5 d內(nèi)，即果實膨大期和轉(zhuǎn)紅期，3齡樹和5齡樹桑果果肉總黃酮含量基本保持一致；接近成熟階段，3齡樹桑果果肉總黃酮含量比5齡樹高。結(jié)果表明，桑果果肉的總黃酮在成熟期合成速率最快，且成熟階段樹齡小的桑果有利于合成總黃酮。

2.1.3 酚酸含量的變化

由圖3可以看出，桑果在發(fā)育過程果肉酚酸含量呈現(xiàn)平穩(wěn)上升趨勢?；ê?5 d內(nèi)，即膨大期和轉(zhuǎn)紅期，3齡樹桑果果肉酚酸含量從1.78 GAE mg/g·FW增長到2.23 GAE mg/g·FW，增長了1.25倍，5齡樹則從0.90 GAE mg/g·FW 增長到 1.11 GAE mg/g·FW，增長了1.23倍，轉(zhuǎn)紅期增長速率略大于膨大期。桑果在成熟期的酚酸合成速率加快，3齡樹桑果果肉酚酸含量從2.23 GAE mg/g·FW增長到3.86 GAE mg/g·FW，增長了1.73倍，5齡樹則從1.11 GAE mg/g·FW增長到2.17 GAE mg/g·FW，增長了1.96倍。整個發(fā)育過程，3齡樹桑果果肉酚酸含量均高于5齡樹，且隨著桑果的生長發(fā)育，相差越來越大。結(jié)果表明，隨著果實的發(fā)育，桑果果肉中酚酸含量及增長速率均緩慢提升，樹齡越大，桑果酚酸的合成能力越弱。

圖3 桑果發(fā)育期果肉酚酸含量的變化Fig.3 The changes of total phenolic acid contents in mulberry fruit with its development

2.1.4 單寧含量的變化

圖4 桑果發(fā)育期果肉單寧含量的變化Fig.4 The changes of total tannin contents in mulberry fruit with its development

由圖4可以看出，隨著桑果的發(fā)育，3齡樹和5齡樹桑果果肉單寧含量呈現(xiàn)“升-降-升”的變化規(guī)律。即膨大期桑果果肉單寧含量上升，轉(zhuǎn)紅期桑果果肉的單寧含量下降，成熟期桑果果肉的單寧含量又上升。膨大期的3齡樹桑果果肉單寧含量增長到1.18 mg/g的高峰后下降到0.83 mg/g，5齡樹桑果果肉的單寧含量則增長到了2.22 mg/g的高峰后下降到1.09 mg/g；成熟期3齡樹桑果果肉的單寧含量增長到4.25 mg/g，5齡樹桑果則增長到6.06 mg/g。在桑果整個發(fā)育過程中，5齡樹桑果果肉單寧含量一直比3齡樹的高。結(jié)果表明，桑果膨大期，其單寧合成速率加強(qiáng)且大于消耗；轉(zhuǎn)紅期，其單寧消耗加強(qiáng)且大于合成；在桑果成熟階段，單寧的含量又出現(xiàn)了增長的趨勢，且增長的速率明顯大于膨大期。故桑果果肉中單寧在成熟期合成速率最快，樹齡大的桑果單寧合成能力強(qiáng)。

2.1.5 葉綠素及類胡蘿卜素含量的變化

2.1.5.1 葉綠素a

圖5 桑果發(fā)育期果肉葉綠素a含量的變化Fig.5 The changes of chlorophyll-a contents in mulberry fruit with its development

桑果在膨大和轉(zhuǎn)紅過程中需要消耗葉綠素 a，外觀上桑葚的顏色也是從濃綠色慢慢變淡再轉(zhuǎn)為紅色，最后趨于紫黑色。由圖5可以看出，在發(fā)育過程中，桑果果肉葉綠素a含量快速下降后趨于穩(wěn)定。在膨大期和轉(zhuǎn)紅期，3齡樹果肉葉綠素 a含量從 30.06 mg/g·FW下降到6.08 mg/g·FW，為開始時的20.21%，5齡樹桑果則從30.40 mg/g·FW下降到6.6 mg/g·FW，為開始時的21.71%。成熟期桑果果肉葉綠素a的含量稍有增長。在桑果發(fā)育的整個過程中，3齡樹和5齡樹桑果果肉葉綠素a含量、變化趨勢、變化速率都基本一致。

2.1.5.2 葉綠素b桑果果肉葉綠素b含量從15.43 mg/g·FW下降到8.85 mg/g·FW，5齡樹桑果果肉葉綠素 b含量則從 15.35 mg/g·FW下降到7.43 mg/g·FW。由此可以看出，膨大和轉(zhuǎn)紅期桑果果肉葉綠素b不斷消耗的，且5齡樹的下降速率要大于3齡樹。成熟期3齡樹桑果果肉葉綠素b含量上升到14.68 mg/g·FW，5齡樹桑果果肉的葉綠素b含量上升到19.89 mg/g·FW，5齡樹的增長速率大于3齡樹。結(jié)果表明，葉綠素b合成速率在成熟期快速上升，樹齡大的桑果在成熟期合成葉綠素b的能力強(qiáng)。葉綠素含量變化規(guī)律與劉長英[15]等研究結(jié)論一致。

圖6 桑果發(fā)育期果肉葉綠素b含量的變化Fig.6 The changes of chlorophyll-b contents in mulberry fruit with its development

2.1.5.3 類胡蘿卜素

圖7 桑果發(fā)育期果肉類胡蘿卜素的含量變化Fig.7 The changes of carotenoid contents in mulberry fruit with its development

由圖7可以看出，在發(fā)育過程中，桑果果肉類胡蘿卜素含量先下降后上升。膨大期和轉(zhuǎn)紅期，3齡樹果肉類胡蘿卜素含量從 4.42 mg/g·FW 下降到 1.27 mg/g·FW，5齡樹果肉類胡蘿卜素含量則從 3.86 mg/g·FW下降到1.67 mg/g·FW。3齡樹果肉類胡蘿卜素含量下降速率要大于5齡樹。成熟期3齡樹果肉類胡蘿卜素含量從1.27 mg/g·FW增長到3.74 mg/g·FW，5齡樹果肉類胡蘿卜素含量則從1.67 mg/g·FW增長到7.26 mg/g·FW，5齡樹增長速率大于3齡樹。結(jié)果表明，桑果的類胡蘿卜素合成速率在成熟期快速上升，樹齡大的桑果在成熟期合成類胡蘿卜素的能力強(qiáng)。

2.1.6 花色素苷含量的變化

由圖8可以看出，發(fā)育過程中的桑果果肉花色素苷含量先基本不變后突然上升。在膨大期和轉(zhuǎn)紅期，3齡樹果肉花色素苷含量從0 mg/g增長到了0.11 mg/g，5齡樹果肉花色素苷則從0 mg/g增長到0.03 mg/g，增長量非常小。到了成熟期，增長速率突然加快。3齡樹果肉花色素苷含量增長到了1.38 mg/g，5齡樹則增長到1.39 mg/g。在整個發(fā)育過程中，3齡樹和5齡樹桑果果肉花色素苷含量、變化趨勢都基本一致。結(jié)果表明，桑果在膨大期和轉(zhuǎn)紅期果肉中花色素苷合成非常少，但成熟期大幅上升，因此果實顏色向紫黑色變化，樹齡對于桑果果肉花色素苷的代謝沒有影響。與劉長英等[15]研究結(jié)論一致。

圖8 桑果發(fā)育期果肉花色素苷含量的變化Fig.8 The changes of anthocyanidin glycoside contents in mulberry fruit with its development

2.1.7 可溶性糖含量的變化

圖9 桑果發(fā)育期果肉可溶性糖含量的變化Fig.9 The changes of soluble sugar contents in mulberry fruit with its development

糖是果實中最重要也是最廣泛存在的生物活性物質(zhì)，對于人體的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降低血糖以及提高免疫力有著重要的作用[16]。

由圖9可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉可溶性糖含量先不變后上升。膨大期和轉(zhuǎn)紅期桑果果肉可溶性糖含量維持在0.0111%～0.0112%之間，基本沒有變化。成熟期，果肉可溶性糖含量大幅度升高。3齡樹果肉可溶性糖含量上升到了 0.06%，5齡樹果肉可溶性糖含量則上升到了 0.05%。在發(fā)育的整個階段，3齡樹和5齡樹桑果果肉可溶性糖含量基本保持一致。結(jié)果表明，桑果果肉中可溶性糖的變化規(guī)律和花色素苷基本一致，在膨大期和轉(zhuǎn)紅期含量穩(wěn)定，成熟期突然上升，且樹齡對于桑果糖的代謝沒有影響。不同的是果實膨大之前就已經(jīng)含有可溶性糖。

2.2 桑果發(fā)育期果肉抗氧化酶活性的變化

2.2.1 總抗氧化能力

圖10 桑果發(fā)育期果肉總抗氧化能力的變化Fig.10 The changes of total antioxidant capacity in mulberry fruit with its development

由圖10可以看出，隨著桑果的發(fā)育，果肉總抗氧化能力不斷提高，越接近成熟，其總抗氧化能力越強(qiáng)。在桑果發(fā)育整個過程中，5齡樹桑果果肉總抗氧化能力比3齡樹強(qiáng)，越接近成熟，兩者相差越大。樹齡越大的桑果總抗氧化能力比越強(qiáng)。

2.2.2 超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化

圖11 桑果發(fā)育期果肉超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化Fig.11 The changes of the activity of superoxide dismutase in mulberry fruit with its development

由圖11可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉SOD活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。轉(zhuǎn)紅期3齡樹果肉SOD活性增強(qiáng)，但5齡樹果肉SOD活性繼續(xù)下降。5齡樹桑果果肉 SOD活性無論是下降趨勢還是上升趨勢，其速率均比3齡樹都要快。

2.2.3 過氧化氫酶（CAT）活性的變化

由圖12可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉CAT活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

膨大期桑果果肉CAT活性下降速率快，轉(zhuǎn)紅期變化小，成熟期桑果果肉CAT活性上升。在轉(zhuǎn)紅期和成熟期，3齡樹和5齡樹桑果果肉CAT活性相近，而膨大期3齡樹桑果果肉CAT活性大于5齡樹。即樹齡大的桑果果肉CAT活性弱。

圖12 桑果發(fā)育期果肉過氧化氫酶（CAT）活性變化Fig.12 The changes of the activity of superoxide dismutase in mulberry fruit with its development

2.2.4 過氧化物酶（POD）活性的變化

圖13 桑果發(fā)育期果肉過氧化物酶（POD）活性的變化Fig.13 The changes of the activity of peroxidase in mulberry fruit with its development

由圖13可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉POD活性呈現(xiàn)下降趨勢，下降速率隨著桑果的發(fā)育而降低。整個發(fā)育過程中，3齡樹和5齡樹桑果果肉POD活性基本一致。

圖14 桑果發(fā)育期果肉抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化Fig.14 The changes of the activity of ascorbate peroxidase in mulberry fruit with its development

2.2.5 抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性的變化活性在膨大期下降非?？?，轉(zhuǎn)紅期和成熟期下降緩慢。整個發(fā)育期5齡樹桑果果肉APX活性要比3齡樹高。即樹齡大的桑果果肉APX活性稍強(qiáng)。

2.2.6 苯丙氨酸解氨酶（PAL）酶活性的變化

圖15 桑果發(fā)育期果肉苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的變化Fig.15 The changes of the activity of phenylalnine ammonialyase in mulberry fruit with its development

由圖15可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉PAL活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

果肉PAL活性在膨大期下降，轉(zhuǎn)紅期緩慢上升，成熟期大幅上升。膨大期和轉(zhuǎn)紅期 5齡樹桑果果肉PAL活性大于3齡樹，但成熟期3齡樹桑果果肉PAL活性卻大于5齡樹。即樹齡大的成熟桑果果肉PAL活性弱。

2.3 各抗氧化酶活性與總抗氧化能力之間的相關(guān)性

由圖14可以看出，發(fā)育過程中桑果果肉APX活性呈現(xiàn)出快速下降后緩慢下降的趨勢。桑果果肉APX

圖16 各抗氧化酶活性與總抗氧化能力之間的相關(guān)性Fig.16 The correlation between antioxidant activity and total antioxidant capacity

桑果果肉各抗氧化酶活性與總抗氧化能力之間的相關(guān)性結(jié)果如圖16所示。5齡樹桑果果肉過氧化物歧化酶（SOD）活性、3齡樹和5齡樹桑果果肉過氧化氫酶（CAT）活性與總抗氧化能力的相關(guān)性較低；其他抗氧化酶活性與總抗氧化能力表現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性，它們的活性強(qiáng)弱在一定程度上影響著桑果果肉的總抗氧化能力。其中，3齡樹桑果肉SOD活性、PAL活性和5齡樹桑果果肉PAL活性與總抗氧化能力呈正相關(guān)性，3齡樹和5齡樹桑果果肉POD、APX活性與總抗氧化能力呈負(fù)相關(guān)。桑果果肉CAT活性對總抗氧化能力的促進(jìn)作用隨著樹齡的增大不斷提高，其余四個抗氧化酶活性對總抗氧化能力的促進(jìn)作用隨著樹齡的增大而降低。與總抗氧化能力相關(guān)性最強(qiáng)的為3齡樹桑果果肉PAL活性，次之為3齡樹桑果果肉SOD活性和5齡樹桑果果肉PAL活性。POD和APX活性相關(guān)性接近。

3 結(jié)論

3.1 桑果發(fā)育期果肉生物活性物質(zhì)的變化規(guī)律

桑果果肉中生物活性物質(zhì)變化規(guī)律與果實成熟度有關(guān)。本文測定了桑果果肉中總酚、黃酮、酚酸、單寧、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、花色素苷及可溶性糖等生物活性物質(zhì)，其中總酚、黃酮及酚酸隨著果實發(fā)育，含量不斷增加，故推測它們與果實發(fā)育的關(guān)系更密切。

桑果果肉中生物活性物質(zhì)變化規(guī)律與樹齡大小也有關(guān)。樹齡大的成熟桑果果肉中總酚含量高，而酚酸、黃酮含量卻是樹齡小的含量高，具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 桑果發(fā)育期果肉抗氧化酶活性的變化規(guī)律

桑果果肉的抗氧化酶活性變化規(guī)律與果實成熟度有關(guān)。與桑果成熟度在桑果發(fā)育過程中，果肉內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性先下降后上升；過氧化物酶（POD）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性逐漸降低；總抗氧化能力逐漸上升。

桑果果肉的抗氧化酶活性變化規(guī)律與樹齡也有關(guān)。樹齡越大，成熟桑果果肉的SOD、CAT、PAL活性弱，APX活性與總抗氧化能力強(qiáng)，但不同樹齡之間的桑果果肉POD活性相差不大。