四子種王膠囊對(duì)少弱精子癥患者治療前后的精子質(zhì)量、氧化應(yīng)激損傷及ACP、HYD、ACE表達(dá)的影響

王 琰，王旭初，盧 娜，王慧君

0 引言

少弱精子癥是引起男性不孕的主要原因之一[1]。隱睪、精索靜脈曲張、生殖道感染、內(nèi)分泌疾病、免疫異常、遺傳疾病等是該病癥主要的誘因[2]，但仍然有70%以上的男性不育病因不明[3]，即使已知病因的不育中，其發(fā)病機(jī)制也尚未完全闡明[4]?，F(xiàn)階段以營(yíng)養(yǎng)療法、激素治療、外科手術(shù)和抗感染輔助生殖技術(shù)等作為主要的治療方案，但均未達(dá)到理想的效果[5]。中醫(yī)對(duì)少弱精子癥的治療，生精功能的改善方面以辨證論治為原則，具有一定的療效[6]。雖然有報(bào)道，精液中精子的數(shù)量和活動(dòng)精子的百分率與自然妊娠率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的相關(guān)性[7]，但臨床仍有1/3的男性不育患者的精液常規(guī)分析結(jié)果正常或接近正常[8]。因此，依靠精液常規(guī)分析判斷男性生育能力具有局限性，對(duì)于具有此癥狀超過1年的患者應(yīng)進(jìn)行精子功能檢查，如：精子-透明質(zhì)酸結(jié)合實(shí)驗(yàn)，精子頂體酶活性定量，鈣離子誘發(fā)頂體反應(yīng)，精子的氧化應(yīng)激損傷，以及精子頂體內(nèi)其他酶的活性(ACP、HYD、ACE)等指標(biāo)，這些指標(biāo)均與不育有關(guān)[9-11]。四子種王膠囊有補(bǔ)腎益氣、通脈化瘀、通腹將濁的功效。中醫(yī)將腎虛作為引起男性不育的一個(gè)重要原因，其中主要病因?yàn)槟I精虧虛，腎陽不振。因此，對(duì)男性不育癥的主要治療方法為補(bǔ)腎益精。四子種王膠囊方中韭菜子、淫陽藿、肉蓯蓉、鹿角膠、覆盆子等均為補(bǔ)陽之品，其作用為固腎生精，益腎壯陽，另外還有補(bǔ)肝、滋陰養(yǎng)血、去風(fēng)除濕等功效，有提高精子數(shù)量及質(zhì)量、改善精子功能等功效，但作用機(jī)制尚不清楚。本文旨在研究四子種王膠囊在治療少弱精子癥患者中的作用機(jī)制及療效。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇我院2016年5月至2017年5月入院確診的126例不育癥患者，年齡22～31歲，患者已婚，均為正常性生活，除外女方不育原因者。入選標(biāo)準(zhǔn)[12]：婚后1年時(shí)間以上未采用避孕，正常性生活，女方正常生育力，采用3次以上標(biāo)準(zhǔn)精液分析，精子均顯示濃度低，a級(jí)精子活動(dòng)率小于25%，a+b級(jí)精子活動(dòng)率小于50%?；颊呔哂休^好的依從性，均知情同意(批號(hào)：2017073)。排除標(biāo)準(zhǔn)[13]：勃起功能障礙，射精障礙，無精子癥；泌尿生殖系統(tǒng)先天畸形，于近期服用影響精子活力和生精功能的藥物(抗癲癇、抗腫瘤藥物)；精子或染色體出現(xiàn)基因異常；存在精神疾病，或具有肝、腎、造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病，心血管疾病。排除生殖系統(tǒng)嚴(yán)重炎癥以及精索曲張等其他可能導(dǎo)致男性不育的疾病。

1.2 用藥方案 對(duì)照組常規(guī)西醫(yī)方案：進(jìn)餐時(shí)口服左卡尼汀口服溶液(東北制藥，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990372) 10 ml/次，早晚各1次；葡萄糖酸鋅片(海南制藥廠有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H46020030)，1片/次，3次/d，治療3個(gè)月。觀察組治療方案：在常規(guī)西藥治療的基礎(chǔ)上，加四子種王膠囊(冀藥制字z20070043)，5粒/次，2次/d，連服3個(gè)月。四子種王膠囊藥物組成：淫羊霍18 g，韭子12 g，石斛9 g，菟絲子10 g，肉蓯蓉8 g，覆盆子8 g，桑寄生9 g，懷牛膝10 g，蠶蛾9 g，鹿角膠20 g，熟地12 g，枸杞子8 g，當(dāng)歸15 g。

1.3 精子標(biāo)本來源 患者禁欲3～5 d，用新潔爾滅消毒手及尿道口，手淫法將全部精液置于無菌塑料容器內(nèi)，至37 ℃恒溫水浴箱中，孵育30 min，完全液化后，取20 μl稀釋于380 μl精子稀釋液中，高倍鏡下計(jì)數(shù)四角及中央5個(gè)方格內(nèi)精子數(shù)，參考值：精子計(jì)數(shù)>20×109/L。顯微鏡下觀察精子密度、精子活動(dòng)率和精子畸形率。依據(jù)WHO判斷精子活動(dòng)度的標(biāo)準(zhǔn)[14]，精子活力分4級(jí)：a級(jí)精子活動(dòng)良好，呈快速、活潑、直線向前運(yùn)動(dòng)；b級(jí)精子能活動(dòng)，但方向不明確，呈快速或遲鈍直線或非直線向前運(yùn)動(dòng)；c級(jí)精子活動(dòng)不良，原地打轉(zhuǎn)或旋轉(zhuǎn)，向前運(yùn)動(dòng)能力差；d級(jí)精子不活動(dòng)。精子活動(dòng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：<20%，20%～40%，>40%。少精癥為精子密度<20×106/ml，>5×106/ml；弱精癥：活率<75%，a+b級(jí)精子活力<50%或a級(jí)精子活力<25%；少弱精子癥患者均低于以上標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 精液ACP、HYD、ACE檢測(cè) ACP活性檢測(cè)方法[15]：取1 ml精液，用Earle液洗滌2遍，500 r/min離心10 min，配成1×106精子/ml懸液置于37 ℃ 1 h使之獲能，加入1 mmol孕酮至終濃度10 μmol/L誘導(dǎo)頂體反應(yīng)，1 h后，1 000 r/min離心1 min，取上清10 μl，利用磷酸苯二鈉法檢測(cè)ACP活性。

ACE、HYD檢測(cè)方法[16]：精液經(jīng)1 000 r/min離心10 min，留下層沉淀物，經(jīng)PBS清洗2次，最終將沉淀精子懸浮于PBS緩沖液中。利用改良的明膠底物膜片和改良透明質(zhì)酸-明膠底物膜片，置于37 ℃恒溫孵箱，3 h后取出，干燥后，顯微鏡下觀察結(jié)果。均勻選取5～6個(gè)視野，觀察100個(gè)精子，通過判斷精子頭部是否出現(xiàn)暈環(huán)判斷ACE和HYD是否陽性。利用顯微鏡上的微尺檢測(cè)暈環(huán)直徑大小，以直徑大小判斷ACE和HYD活性強(qiáng)度。

1.5 ROS、MDA、SOD檢測(cè)方法 利用精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧(ROS)魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)精子細(xì)胞中ROS水平，具體操作見產(chǎn)品說明書(GENMED精子細(xì)胞氧化應(yīng)激活性氧魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒，上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)。利用精子細(xì)胞MDA和超氧化物歧化酶(SOD)含量比色法定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)MDA和SOD含量，其中MDA采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)(南京建成生物研究所)。具體操作參照產(chǎn)品說明書。

2 結(jié)果

2.1 兩組精子密度比較 治療后，觀察組、對(duì)照組患者的精子密度均得到改善(P<0.05)，且觀察組高于對(duì)照組(P<0.05)；通過精子活率評(píng)估精子質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，兩組治療前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，治療后，觀察組精子活率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。見表1。

2.2 兩組精子活動(dòng)度及精子畸形率比較 治療前，兩組精子活動(dòng)度和畸形率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后鏡檢觀察顯示，觀察組患者精子活動(dòng)度增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 兩組患者ACP活性檢測(cè)結(jié)果 治療后，兩組患者ACP活性均達(dá)到了正常范圍，觀察組ACP活性高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.4 兩組HYD、ACE陽性率及活動(dòng)強(qiáng)度比較 治療前兩組HYD、ACE及活動(dòng)度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療后，觀察組HYD、ACE陽性率及HYD、ACE活性強(qiáng)度高于對(duì)照組(P<0.05)。見表3。

2.5 兩組氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較 治療前，兩組氧化應(yīng)激損傷相關(guān)指標(biāo)(ROS、MDA、SOD等)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后，觀察組ROS、MDA水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，SOD水平高于對(duì)照組(P<0.05)。見表4。

2.6 不良反應(yīng) 治療期間，兩組患者均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

表1 不同方案治療后精子密度比較

表2 治療后兩組精子活動(dòng)度及精子畸形率比較

表3 兩組患者HYD、ACE陽性率及活性強(qiáng)度比較(n=63)

表4 兩組患者氧化應(yīng)激指標(biāo)比較(n=63)

3 討論

精子形態(tài)、密度、活率是受精過程中的重要參數(shù)[17]。精子形態(tài)有頭端染色致密濃縮的細(xì)胞核，細(xì)胞核周圍有一層很薄的細(xì)胞質(zhì)。前端富含多種溶酶體酶，主要有頂體酶ACE、透明質(zhì)酸酶HYD和酸性磷酸酶ACP。精漿ACP與精子密度、活動(dòng)率及活力相關(guān)，精漿ACP活性可作為男性不育精子質(zhì)量檢測(cè)的指標(biāo)之一。而頂體酶ACE活性的不足可導(dǎo)致不育、臨床精子存活率低、死精癥以及嚴(yán)重的生殖系統(tǒng)感染，特別是解脲支原體感染可導(dǎo)致精子頂體酶活性低，目前，頂體酶活性定量是判斷男性精子功能和生育力強(qiáng)弱的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組患者的各項(xiàng)生殖指標(biāo)均優(yōu)于單純常規(guī)西醫(yī)治療組，提示四子種王膠囊在治療男性不育方面有較好的療效。其不僅提高了精子的濃度，還改善了精子的運(yùn)動(dòng)能力，推測(cè)四子種王膠囊可能通過改善睪丸供血或生殖內(nèi)分泌，促進(jìn)精子生成。

本研究顯示，觀察組精子內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的改善程度優(yōu)于對(duì)照組。ROS是信號(hào)傳導(dǎo)中的重要媒介，能調(diào)節(jié)精子的獲能和頂體反應(yīng)等正常生理過程[19]。SOD則為精漿中清除ROS的活性酶[20]，ROS的產(chǎn)生和清除存在一定的平衡，若平衡被打破，則產(chǎn)生一定的氧化應(yīng)激損傷。維生素E能夠維持谷胱甘肽過氧化物酶活性，有利于MDA清除，改善SOD活性。四子種王膠囊的成分復(fù)雜，但整體明顯改善了氧化應(yīng)激損傷，清除了過多的自由基，改善了體內(nèi)的抗氧化能力，進(jìn)而改善附屬性腺的分泌功能，提高精子的運(yùn)動(dòng)能力。有報(bào)道，ROS對(duì)精子的損傷是導(dǎo)致男性不育的重要病因[21-22]。正常情況下，一定程度受控的ROS在精子獲能、精子高活躍性運(yùn)動(dòng)以及頂體反應(yīng)中起重要作用，當(dāng)ROS產(chǎn)生超出了抗氧化系統(tǒng)的清除能力，則產(chǎn)生多種毒性作用，損傷生精功能[23]。因此，ROS以及與之平衡相關(guān)的SOD的平衡對(duì)維持正常的生理功能發(fā)揮重要作用。 綜上所述，補(bǔ)腎益精治療可以很好地改善少弱精子患者的生精功能，其能改善ROS、SOD等指標(biāo)，改善的氧化還原環(huán)境可能有利于精子的發(fā)生和成熟。總之，四子種王膠囊在治療少弱精子癥患者的機(jī)制復(fù)雜多樣，其可能通過多種機(jī)制、多靶點(diǎn)改善精液質(zhì)量，進(jìn)而治療男性不育癥。