牛磺鵝去氧膽酸對(duì)FLS細(xì)胞中GR介導(dǎo)的HSP 90基因表達(dá)的影響

寶力格 ，周 蕾 ，郝大成 ，朱相成 ，羅宏亮 ，3，李培鋒

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動(dòng)物臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特010018；3.內(nèi)蒙古金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

牛磺鵝去氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）是膽汁酸（bile acids，BAs）的主要活性成分之一，是一種結(jié)合型膽汁酸。其分子式為C23（OH）2H37CONHCH2CH2SO3H，主要存在于雞、鴨、鵝、熊等動(dòng)物膽汁中，在雞膽汁中其含量最高［1-4］。

研究表明，TCDCA具有顯著的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用［1-4］，其抗炎免疫調(diào)節(jié)作用與糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)的基因組學(xué)信號(hào)通路有關(guān)［5］。熱休克蛋白 （heat shock proteins，HSPs）是生物體受到環(huán)境中物理、化學(xué)、生物、精神等因素刺激時(shí)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而合成的高度保守的蛋白質(zhì)［6］。 熱休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）作為HSPs最重要的成員之一，表達(dá)于所有的真核細(xì)胞，但其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)比相應(yīng)的正常細(xì)胞高出2～10倍［7］。同時(shí)HSP90是GR必需的分子伴侶，承擔(dān)了“分子開(kāi)關(guān)”的作用。GR與HSP90和免疫親和素（IP）結(jié)合成的復(fù)合物，以未活化型存在于細(xì)胞胞漿內(nèi)，當(dāng)機(jī)體受到刺激后，糖皮質(zhì)激素進(jìn)入靶細(xì)胞，與GR受體結(jié)合后，HSP90等與受體結(jié)合的蛋白質(zhì)解離。為此，進(jìn)一步探討TCDCA激活GR受體后對(duì)HSP 90表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，可深入揭示TCDCA抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雄性SPF級(jí)SD大鼠，購(gòu)自?xún)?nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心。TCDCA，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；弗氏完全佐劑，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DEME高糖液體培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（Excell Bio）；DPBS （Gibco）；AXYGEN總RNA試劑盒 ；RT SuperMix；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）購(gòu)于 Roche 公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

表1 TCDCA對(duì)FLS細(xì)胞中HSP90mRNA表達(dá)量的影響

1.2 研究?jī)?nèi)容與方法

1.2.1 成纖維樣滑膜細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：按照文獻(xiàn)［5］中的方法建立AA模型。選擇體重在（100±20）g的SD大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)，首先讓其在所處的新環(huán)境適應(yīng)1周，之后待大鼠在體重大約達(dá)到（150±20）g進(jìn)行造模，利用弗氏完全佐劑進(jìn)行AA大鼠模型的誘導(dǎo)，于AA大鼠組每只鼠左后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 mL。在AA大鼠模型誘導(dǎo)13～15 d后，將模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判定為造模成功的大鼠處死。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)細(xì)胞，用含有20%胎牛血清、青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，之后每隔2～3 d換液1次，如有大量成纖維滑膜細(xì)胞長(zhǎng)出后可移除組織塊。

當(dāng)原代培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞連成片狀時(shí)可進(jìn)行傳代。該試驗(yàn)采用胰酶消化法傳代培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞再次呈單層密集貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)，再用同樣的方法進(jìn)行傳代，傳至3～5代時(shí)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 分組與給藥：試驗(yàn)分組與給藥見(jiàn)表1。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中大鼠糖皮質(zhì)激素受體 （GR）的cDNA序列 （M14053.1），應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)合成引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

β-actin上游 ：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′；下游 ：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 HSP90上游 ：5′-TCAGGGTTTATCTCCAGGTGT-3′；下游 ：5′-AAGGTTGAAAAGGTGGTTGTG-3′。

1.2.4 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)FLS細(xì)胞中HSP 90mRNA表達(dá)量測(cè)定：待第4代的FLS細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)貼壁后，按照5×105cell/mL的細(xì)胞濃度加入到六孔板中過(guò)夜培養(yǎng)，待細(xì)胞的融合度達(dá)到80%～90%進(jìn)行試驗(yàn)。按照AXYGEN總RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的提取，按照Q RT SuperMix說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄得到30 μL體系的cDNA。FLS細(xì)胞中HSP 90mRNA表達(dá)量用FastStart Universal STBR Green Master（Rox）檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配置20 μL q-PCR反應(yīng)體系：模板 2μL，上游引物0.8μL，下游引物 0.8μL，SYBR染料6.4μL，用去離子水補(bǔ)至20μL。用 2-ΔCt［ΔCt=Ct（HSP 90）-Ct（β-actin）］公式計(jì)算HSP 90基因的相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)過(guò)程采用40個(gè)循環(huán)，退火溫度為58℃。

圖1 TCDCA對(duì)FLS中HSP 90mRNA表達(dá)的影響

1.2.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：結(jié)果以X±S表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

由圖1可知，未加RU486誘導(dǎo)前，與FLS細(xì)胞對(duì)照組相比10-4、10-5mol/L的TCDCA均可極顯著性（P<0.01）抑制 HSP 90mRNA 的表達(dá)；FLS細(xì)胞對(duì)照組在加入RU486后，HSP 90mRNA的表達(dá)極顯著性（P<0.01）降低。同劑量的TCDCA在加入RU486后，HSP90mRNA的表達(dá)均顯著（10-4mol/L）和極顯著性（10-5mol/L）升高。由以上結(jié)果可以得出TCDCA可通過(guò)GR受體誘導(dǎo)HSP 90mRNA表達(dá)的降低，同時(shí)加入RU486后可抑制TCDCA對(duì)HSP 90mRNA的作用。

3 討論

HSP90作為機(jī)體重要的分子伴侶蛋白在炎癥反應(yīng)的發(fā)生過(guò)程中具有重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）發(fā)生非細(xì)菌感染引起的炎癥反應(yīng)時(shí)，HSP90發(fā)揮著重要的促炎作用［8］。同時(shí)，在研究機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)的患者時(shí)，機(jī)體HSP32、HSP70和HSP90表達(dá)量發(fā)生顯著性升高，由此可知炎癥反應(yīng)的發(fā)生可以促進(jìn)HSP90的表達(dá)［9］，HSP90 是一種重要的促炎因子。 因此，該研究以AA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）為研究對(duì)象，研究了TCDCA對(duì)AA大鼠FLS中HSP 90mRNA表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示，TCDCA能夠極顯著 （P<0.01）抑制AA大鼠FLS中 HSP 90mRNA的表達(dá)；而當(dāng)加入GR阻斷劑預(yù)處理后，TCDCA對(duì)HSP 90mRNA表達(dá)的抑制效應(yīng)減弱。由此可知，TCDCA可通過(guò)GR受體抑制促炎因子HSP 90基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗炎作用。